文献信息
标题：Differential gene expression analysis tools exhibit substandard performance for long non-coding RNA-sequencing data
DOI(url): https://doi.org/10.1186/s13059-018-1466-5
发表日期：24 July 2018
关键词： lncRNA, Differential gene expression, RNA-seq, differential expression
文献概述
首先需要说明一点，自己目前不怎么做 lncRNA 了，但是发现和它相关的内容还是忍不住多看一眼。
这篇文章详细的分析了不同标准化和差异分析方法在 lncRNA 分析中的差别。一共使用了25个分析流程，主要关注点是 lncRNA 和一些低表达 mRNA。使用15种指标来评估差异基因的分析方法和标准化方法，一共使用了 6 中不同 RNA-seq 数据集，同时还提供了一个 shiny 网页可视化工具用来展示这些分析结果。按道理类似类型的文章应该达不到这个水平的杂志，lncRNA 分析方法的测评能够发到 Genome Biology 上也是牛，想必定有过人之处。
简单说最后的结论是使用 limma 和 SAMSeq 分析lncRNA 或者表达量很低的mRNA 效果要稍微好些，值得注意的是，为了获得至少 50％ 的 sensitivity，在实际环境（如临床癌症研究）中研究表达水平时需要超过80个样本（what ?）。测试使用的大约一半的方法显示出过多的假阳性，非常不可靠。
笔记
lncRNA 研究的主要问题就是表达量太低，在一些软件中往往是要求去除掉表达量很低的基因，这个时候就非常尴尬。
作者为此挑选了一些引用率较高的软件，这些软件的共同点是都有 R 包可以使用，而且都是用原始的 read counts 作为输出。在数据方面，作者使用了不同规模的 6 个数据，基本上可以概括进行差异分析的不同情况。用作者的话说：据我们所知，我们的研究是迄今为止所进行的最大的实例 评估，包括所使用的真实数据集的数量，评估的指标数量以及DE流程数量。
差异分析工具
使用的差异分析工具如下：
| Tool (package version) | Pipelines | Citationsa |
|---|---|---|
| edgeR (3.14.0) | (1) Exact test based on NB distribution, (2) GLM with NB family, (3) QL, (4–7) robust GLM with four different prior DF | 5406 |
| DESeq (1.24.0) | (1) Default, exact test based on NB distribution | 4655 |
| DESeq2(1.12.4) | Fits GLM with NB family. (1) Default, (2) independent filtering disabled (setting1), (3) independent filtering disabled and outlier-detection off (setting2) | 1364 |
| limma (3.25.21) | Fits linear models on log-transformed counts. (1) Voom, (2) voom (robust), (3) trended, (4) trended (robust), (5) voom+QW, (6) limmaVST, (7) limmaQN | 1828 |
| NOISeq (2.12.1) | (1) Default, data-adaptive and non-parametric method | 524 |
| baySeq (2.6.0) | (1) Default, Bayesian methods with empirical prior distributions | 315 |
| SAMSeq (samr, 2.0) | (1) Default, non-parametric method based on Wilcoxon rank sum statistic | 140 |
| PoissonSeq (1.1.2) | (1) Default, uses poisson log-linear model | 92 |
| QuasiSeq (1.0.8) | Fits GLM with NB family. (1) QL, (2) QLShrink, (3) QLSPline | 57 |
分析过程
- first we evaluated various normalization procedures
- second we compared the level of agreement among DE pipelines using various publicly available RNA-seq datasets;
- third we explored the ability of the DE pipelines to recover known evidence of differential expression;
- fourth we used simulation procedures to evaluate and compare the performance of the tools under a variety of gene expression experiment scenarios, such as variability, sample size, and fraction of DE genes.
标准化方法比较
结论是除了 quantile normalization (QN)，其它几种标准化的方法都差不多。 另外，终于在文献里看到了upsetR 画出来的图。
一致性分析
主要检查指标：
- number of genes identified as significantly differentially expressed (SDE);
- similarity in terms of the set of SDE genes;
- the degree of agreement on gene ranking;
- similarity of fold-change estimates;
- handling of genes with special characteristics (lncRNAs, genes with low counts, genes with outliers)
- computation time
这里的分析结果是使用聚类方法展示的，如果看懂了就很能说明问题。
下图中的abcd 分别代表： a fraction of significantly differentially expressed (SDE) genes detected at 5% FDR, b overlap among pipelines in detecting SDE genes at 5% FDR, c gene ranking agreement, and d similarity of log fold-change (LFC) estimates)
DESeq, baySeq, limmaQN,和 NOISeq 聚在一起，总之就是比较差。 QuasiSeq (both settings), edgeR robust (with both tested prior degrees of freedom), limmaVoom+QW, PoissonSeq 和 SAMSeq 相对而言就都比价不错。
文章后面有介绍了一些其它数据的比价结果就不一一详细罗列，最后的建议是：limma (with variance stabilizing transformation; voom with or without quality weighting; trend) and SAMSeq control the actual FDR reasonably well, while not sacrificing sensitivity。另外，就是如果做lncRNA，多送一些样本吧。
文章上传了分析代码，所有几个主要附件都是网页格式，展示所有评测结果还做了个网站。
最后一点让我好奇的是，文章从投稿到接受一共花了8个月的时间，这期间都发生了什么，review 又给了哪些意见呢？
