Cell | 高通量筛选建立DNA双链断裂修复基因图谱

原创 风不止步 图灵基因 今天

收录于话题#前沿分子生物学技术

撰文：风不止步

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亮点：

测量许多基因扰动对靶向DNA断裂时产生突变谱的影响，可系统地定位DNA修复途径。高通量筛选方法Repair-seq，测量数以千计的遗传扰动对目标DNA病变处引入的突变的影响。

重点:

l 修复基因图谱描绘了DNA修复结果的遗传依赖性；

l 高分辨率的基因功能特征识别出意想不到的基因关系；

l 具有相似序列的DSB诱导突变可能来自不同的机制；

l 修复-酶标仪可用于研究广泛的基因组编辑工具；

2021年10月20日，美国Jonathan S.Weissman博士等人在《Cell》上发表了一篇“Mapping the genetic landscape of DNA double strand break repair”的文章。

如果不能正确修复DNA双链断裂（DSBs），就会导致基因组不稳定和细胞死亡。为了处理DSB，真核细胞有一套专门的修复机制，这些机制通常被概念化为一棵决策树，"树枝 "代表导致修复断裂的各种分子事件，"节点 "表示过程之间的过渡点或承诺。在框架内，DSB修复有两个主要分支。第一个，非同源末端连接（NHEJ），包括一套灵活的机制，在整个细胞周期中发挥作用，以促进DSB末端的处理、协同和直接连接；第二种，同源定向修复（HDR），利用DNA的同源区域，在50-30次核溶解切除DSB末端后，促进S/G2的修复。然而，在这些高水平的分支之外，将DSB修复描述为决策树可过度简化一个复杂的机制景观，并掩盖我们理解中的差距和模糊之处。例如，尽管已经确定存在DSB末端连接的替代机制，但很难完全确定，导致从DSB到修复DNA的可能 "路线"的数量不确定。

对DSB修复的理解存在局限性，部分原因是与分析修复结果的决定因素有关的技术挑战。虽然已经进行许多基因筛选来确定DSB修复因子，但这些努力主要是依靠将许多过程的活动混在一起的表型（如生长测定）或使用低分辨率的报告器，限制他们明确界定所确定的基因作用的能力。另外，对酶诱导的DSB产生的突变进行深度测序，通过揭示遗传或化学扰动后修复产物频率的变化，将特定的修复因子牵涉到确定的DSB处理事件中，但到目前为止，这种实验仅限于少量的扰动。

推断同时测量广泛的DSB修复结果的遗传决定因素将使DSB修复的系统研究成为可能。考虑到这一目标，开发一种高通量的方法Repair-seq，结合基因座特异性深度测序和基于CRISPR干扰（CRISPRi）的筛选，以测量成千上万的遗传扰动对目标DNA病变产生的突变谱的影响。利用Repair-seq，研究两种可编程核酸酶（Cas9和Cas12a）诱导的DSBs的修复。对所得到的数据进行系统的探索，分离出负责普通核酸酶诱导的突变的过程，并揭示典型DNA损伤反应基因的意外作用。此外，应用Repair-seq研究不同外源寡核苷酸修复模板的DSB修复。确定一系列基因上不同的过程，通过这些过程，模板序列被整合到断裂处，并证明Repair-seq是一种灵活的方法，可以揭示不同的基因组编辑技术如何与内源性修复过程相互作用。最后利用Repair seq来确定碱基和质点编辑结果的遗传决定因素，从而开发出更有效、更精确的编辑工具。Repair-seq的广泛用途，为进一步探索DNA修复途径奠定了基础。

Repair-seq将基于CRISPR的基因筛查与基因座特异性深度测序结合起来，对许多遗传扰动中的目标DNA病变产生的突变谱进行剖析，从而实现对DNA修复途径的系统性审视。应用Repair-seq调查两种不同的可编程酶（Cas9和Cas12a）在存在和不存在同源修复模板的情况下在五个不同的序列背景下产生的DSBs。这些实验的数据产生一个高分辨率的DSB修复结果的遗传依赖性图谱。对该图集的系统探索表明，表面上相似的序列结构的修复结果可以显示出遗传依赖性的明显差异。此外，发现由微结构包边的缺失可以通过不同的机制产生。然后对不同结果的基因表型进行比较，发现这种缺失的典型媒介（POLQ）和意外的基因（如RAD17）之间存在关联。总的来说，这些观察加深我们对细胞如何修复酶诱导的DSBs的理解，并证明DNA突变分类的力量，而无需先验地登记序列特征。

除了简单的插入和缺失，Repair-seq还能对更复杂的修复结果进行研究。确定在DSBs上调节基因组序列片段或外源ssDNA捕获的基因，包括DNA2和MCM10。与结果一致，DNA2已被提议通过防止生成ssDNA和/或降解细胞内ssDNA来抑制酵母中的这种结果。有趣的是，在数据集中，MCM10对基因组序列捕获的抑制程度与DNA2相当或更大，但DNA2对外源ssDNA的捕获的影响比MCM10大得多。这些表型共同表明一个模型，即MCM10的缺失增加基因组片段的生成，而DNA2也通过降解ssDNA或通过该酶在DSBs上更直接的活性来塑造这一步骤下游的修复结果。这些发现表明，比较不同修复结果的遗传扰动的影响的能力如何能够建议和制约DNA修复事件背后的机制模型。

最后，Repair-seq能够同时测量遗传扰动对广泛的突变的影响，这使它非常适合研究基因组编辑工具产生的DNA损伤是如何以预期和非预期的方式修复的。对使用寡核苷酸修复模板的HDR的研究是对这个概念的原则性证明。此外，在配套的研究中，应用修复基因组图谱来确定碱基和质点编辑的细胞决定因素，并利用从这些筛选中获得的见解来开发效率和精度更高的编辑工具。尽管DNA修复的复杂性对精确的基因组编辑来说仍然是一个艰巨的挑战，但这些研究共同证明Repair-seq是一个解开这种复杂性的强大工具。

教授介绍

Weissman 博士是麻省理工学院的生物学教授，也是兰登·T·克莱生物学教授和怀特黑德生物医学研究所的成员。

目前的研究：细胞系统的蛋白质折叠和翻译及组织原理

Jonathan Weissman对细胞如何确保蛋白质折叠成正确形状感兴趣。Weissman团队专注于识别和理解有效折叠所需的机制，以及研究蛋白质错误折叠的机制和后果。开发实验和分析方法，以探索复杂细胞系统的组织原理，并以前所未有的精度和深度监测体内蛋白质的翻译。连接大规模方法和机械研究的能力是实验室的重点。

研究细胞如何确保蛋白质折叠成正确的形状，以及蛋白质错误折叠在疾病和正常生理中的作用。构建用于广泛探索生物系统组织原则的创新工具。这些包括核糖体分析，它在全球范围内监测蛋白质翻译，CRIPSRi/a 用于控制人类基因的表达和重新连接表观基因组，以及谱系追踪工具，以记录细胞的历史。

参考文献

Jeffrey A. Hussmann, Jia Ling et al .Mapping thegenetic landscape of DNA double-strand break repair.(2021)