前期文章：
- 我们用两篇文章的篇幅大概讲了一遍质粒骨架及其各个要素的介绍：
解剖式学习一个质粒结构--update
质粒系列之什么是质粒 - 再谈了最传统的限制性克隆：
质粒系列之限制性克隆--restriction cloning - 前面还夹杂的讲过一些piggybac、gateway、RMCE的一些内容：
基因编辑如何换药不换汤 -
慢病毒系列也有讲过两篇：
团队作案HEK293，史上最强搬砖细胞
不想再用慢病毒了，我还有什么别的选择吗？piggyBac transposon - 此外我们本还有一个CRISPR screening的专题，只有开头，未得完善：精准大海捞针--5. CRISPR screening专题
- 质粒系列之再谈无缝连接--Gibson assembly
- Golden Gate，质粒改造的王者
- 关于CRISPR-Cas9技术的脱靶效应：CRISPR-Cas9基因编辑--脱靶效应如何检测
- CRISPR和TP53文献解读之：Cas9诱导P53激活并导致细胞死亡
在上一篇文章中我们解读了，CRISPR-Cas9基因编辑诱导DSB（DNA双链断裂）并最终导致人多功能干细胞死亡的内容。其中最关键的是Cas9造成的DSB，激发野生型P53反应，P53激活后将细胞引入凋亡之路。话不多说，直接看下图：
想象一下这个过程：
（1）一个sgRNA-Cas9复合体在细胞核内游走，Cas9蛋白在DNA序列上快速的扫描PAM序列，合适的停顿一会儿，DNA解链，sgRNA尝试互补配对。配对失败，此处不留爷自有留爷处！匹配成功，请看下一点。
（2）Cas9识别到NGG的PAM序列后，sgRNA配对成功，Cas9蛋白切割PAM序列下游第三个碱基处（说是这么说，总也有切偏的时候），产生DNA双链断裂（DSB）。
（3）DSB发生在WT-P53（野生型P53）的细胞中，P53激活诱导该细胞走向：周期阻滞、衰老甚至凋亡。由于人多功能干细胞对DSB十分敏感，其P53反应也十分激烈，容易走向凋亡。这就是上一篇文章的主要发现。
（4）而当DSB发生在mutant-P53（突变型P53）的细胞中时，也有几种情况：（A）该细胞有双链P53突变，则毋庸置疑，P53功能缺失，不再诱导凋亡，细胞得以存活；（B）该细胞有一条链为WT-P53，另一条链为mutant-P53，当这个细胞足够倒霉的时候，它的mutant-P53链产生的mutant-P53蛋白，不仅自己不起功能，还反而抑制另外一条WT-P53起作用！简直坏透了！此时无论如何，细胞仍然不会有正常的P53反应，细胞得以存活，且这些mutant-P53可能会继续传递给后代，mutant细胞群不断壮大！
综上所述，显而易见，CRISPR-Cas9技术俨然成为一个筛选mutant-P53细胞的筛选因子。长此以往，mutant-P53群落越来越大。P53自己突变就算了，关键是当其他的DNA损伤或者基因突变发生时，P53不再执行其“基因卫士”的功能，使得这些DNA损伤或者突变得以传递给后代，当DNA突变积累足够多/巧的时候，肿瘤可能会发生。这就是CRISPR-Cas9技术应用的风险。想想有了前面那样一篇文章，那么后面这篇文章的出现是不是可以理解。
文章解读：Cas9激活P53并富集P53突变
文章发表在2020年的Nature Genetics杂志
经过2018年Nature Medicine的文章，该文就是明确指出DSB激活P53信号，同时他们做的P53 mutant pool在CRISPR-Cas9编辑中能存活，也指示CRISPR-Cas9的mutant-P53富集作用。是不是别人无法再做类似甚至相同的内容了呢？但这篇文章又缘何可以发这么高分？
1. 背景和科学问题
背景：Cas9通常被投入到细胞系中，以实现CRISPR-Cas9介导的基因组编辑。
问题：Cas9表达本身所造成的后果未知。（个人思考：角度非常好，Cas9其实作为一种外源蛋白是否会引起免疫反应？Cas9是否会不依赖sgRNA直接切割，就如同一些核酸内切酶的星号活性一样？）
目的：研究Cas9表达本身是否会引起基因组或者转录组的变化，其后果如何
补充背景：中性基因编辑/操作（人为而非自然选择）可导致细胞系的遗传和转录多样化。例如人为的过表达或者敲除某些基因都会改变细胞系的遗传和转录多样化。然而，目前还不清楚引入特定的“中性”基因是否会对特地基因进行富集或筛选。尤其是Cas9这样常常使用的工具蛋白。
2. 实验设计和主要结果
2.1 Cas9过表达细胞和其亲本细胞对比：查看转录组变化（基因富集情况）
L1000测序+GSEA分析（如下图）：首先作者找到了165对Cas9过表达细胞及其亲本细胞，分别进行L1000测序。L1000测序即对987个landmark基因进行测序，以推测余下11350个基因的表达（就是测重要基因表达）。这里的技术重复不是我们在RNA-seq中常见到的3个，而是高达16个。经由L1000测序后发现有87个差异基因且差异在2倍以上，经由GSEA分析对比。证明Cas9过表达本身对遗传背景有扰动。
数据分析（如下图）：（1）左图c表示，P53 WT细胞上，可见Cas9过表达细胞群有P53相关基因上调。而在P53 mutant组，Cas9组和对照组的P53相关基因无差别（自然了，都突变了还能有下游基因变化么）。（2）右图g表示，在40个P53 WT的细胞中，有相当一部分细胞在Cas9过表达后表现出P53相关激活基因富集的现象。因此，Cas9激活P53得到了直接证据，同时Cas9激活P53这个现象大部分发生在P53 WT组上。原文中有相应的统计表格可查。
注意：这里仅仅是列举了部分代表性结果，作者还做了P53、P21的WB、PCR验证，同时还测试通过免疫荧光提供了Cas9诱导DNA损伤的证据。
2.2 P53 WT细胞及其Cas9过表达株对比：基因突变情况
基于上述结果：P53WT组，Cas9导致--细胞DNA损伤--P53激活--细胞生长被抑制、死亡。那Cas9相当于变相的筛选富集P53 mutant细胞。
Deep (283×) targeted exon sequencing for 447 cancer genes：于是作者找到42对P53WT状态的细胞及其Cas9过表达株，对这些细胞进行447个癌症相关基因的深度测序。经分析后发现Cas9过表达细胞相对于WT细胞有更多的非同义突变（下图a）。同时突变累积TOP3为：SETBP1（与DNA复制相关）、SLC25A13（线粒体载体家族基因）以及TP53基因。<u>这里有一个疑问，TP53不是Top1呀，为啥不研究Top1呢？注意后文有回答</u>。
补充背景：深度测序是指对一个基因组区域进行多次测序，深度可达数百次甚至数千次。这种测序可检测到只占原始样本1%的罕见克隆类型、细胞或微生物。深度测序对癌症、微生物学和其他涉及罕见细胞群分析的研究很有帮助。例如，深度测序可识别肿瘤中的突变，因为在癌症样本中通常包含有许多正常细胞，且肿瘤本身可能包含多种亚克隆。因此本文选用深度测序，可识别到微量的基因突变，从而区分不同基因突变的亚群。
2.3 Cas9是否只特异性富集TP53突变？
从深度测序结果来看，不止TP53突变在Cas9过表达株中富集。那么Cas9富集基因突变细胞是没有bias还是特定富集TP53突变。为了解决这个问题，作者设计了以下实验：
细胞竞争实验：作者将TP53 -null细胞用GFP标记，将P53-null细胞和WT-P53细胞按照1:6混匀，并分组处理：（1）无处理组NIC；（2）空载组EV；（3）Cas9过表达组Cas9。经分组处理后使用流式细胞仪检测GFP细胞占比变化，如下图b所示，Cas9组的TP53-null细胞在14,21天培养后群体壮大，而ARID1A-null、FBXW7-null细胞则没有变化（下图c）。因此<u>Cas9只特异性富集TP53突变细胞</u>，于是回答了2.2中我们提到的问题。
2.4 summary
以上是本文的主要内容，当然后续作者还对CRISPR-Cas9导致TP53突变富集的机制进行了研究和分析，说是在TP53-WT细胞中，cas9诱导的DNA损伤增加了对功能性DNA修复机制的依赖，也做了一系列实验验证，感兴趣的小伙伴需要回原文查看。最后该文提供了一个使用Cas9进行研究的工作流程图，我想这是该文的另一精髓：
（1）首先思考使用的Cas9过表达细胞是否有是WT-P53。如果不是，则无需太但又P53对功能实验的影响；如果是，则需要检查P53通路的激活状态，可选用WB, RT-qPCR试验等。
（2）若Cas9细胞有一定的P53通路激活，则：在后续实验中考虑p53活性的基础水平；尽量避免过多传代Cas9细胞，以免TP53 mutant细胞富集。
（3）即使Cas9细胞有P53活性基础水平，但仍需是否混有TP53 失落亚型细胞：可通过DNA测序鉴定。
（4）鉴定Cas9过表达细胞株的DNA损伤水平，在后续实验中监控DNA损伤水平的变化，定期检测TP53突变状态。
3. 小结
这篇文章使用了多种测序技术，实验设计巧妙，虽不多但都在刀刃上，是一篇很好的干湿结合文章，值得一读，且文末讨论简洁而精彩。上文讲的是CRISPR-Cas9诱导DSB导致细胞死亡，这篇讲的是CRISPR-Cas9无法使得TP53 mutant细胞死亡，简直是天生一对。那么CRISPR-Cas9是依赖DNA修复的技术，TP53是DNA修复的上游信号，是否CRISPR-Cas9对DNA修复功能也有影响呢？下一次，我们将解读一篇关于CRISPR-Cas9技术应用中，TP53状态和DNA修复之间的纠缠。
TP53是一个热门IP，过了这么多年仍然有大量的好文章发表，关于TP53和CRISPR-Cas9之间关系的好文章不仅仅这两篇，我们希望能在这段时间把这类型的经典文章读一遍，加深我们对CRISPR-Cas9技术的理解。感谢大家阅读，再次期盼反馈交流！
