●英文题目：《Selection Increases Mitonuclear DNA Discordance butReconciles Incompatibility in African Cattle》

●期刊：Molecular Biology and Evolution

●影响因子：2025_IF=11.0

●发文单位：中国科学院大学；乌普萨拉大学；西北农林科技大学等多个单位

●摘要：线粒体的功能依赖于线粒体DNA中基因与核基因组之间的协调相互作用。有丝核不相容后的不完美相互作用可能导致适应性降低。跨物种和种群的线粒体DNA渗入是常见的，并且有充分的记录。在杂交或混合个体中，可能有多种策略可以调和有丝核不相容。非洲杂交牛(Bos taurus×B. indicus)展现出性别偏倚的混合，具有来自普通牛(B. taurus)的线粒体DNA和主要来自有驼峰的zebu(B. indicus)的核基因组。在这里，我们利用本地祖先推断方法来确定非洲杂交牛基因组中与线粒体氧化磷酸化过程相关的核功能基因的祖先和分布模式。结果表明，参与有丝核相互作用的大多数核基因都处于选择之下，并且属于有驼峰的zebu祖先。线粒体DNA拷贝数的变化可能有助于在基因表达调节后恢复最佳线粒体功能，减轻或消除线粒体功能障碍。有趣的是，一些在普通牛祖先中富集的核线粒体基因可能起源于古非洲原牛(B.primigenius africanus)的渐渗。它们可能有助于非洲牛对病原体负担的局部适应。我们的研究提供了进一步的支持和新的证据，表明牛在整个大陆的成功定居是一个复杂的机制，涉及适应性渗入、线粒体DNA拷贝数变异、基因表达调控和祖先线粒体相关基因的选择。

●前言：线粒体的生物学功能是通过线粒体DNA (mtDNA)蛋白(由13个基因编码)与约1200个基因表达的核编码蛋白之间的相互作用来协调有丝核相互作用来维持的。有丝核相容性表明，线粒体和核基因的产物必须在物理上和功能上整合(即有丝核一致性)，才能为电子传递系统(ETS)的呼吸复合物提供动力，并使线粒体基因的转录和翻译以及mtDNA的复制成为可能 。当两个进化谱系以性别偏倚杂交或混合时，不匹配的线粒体和核基因类型可能会破坏有丝核相互作用，导致不同程度的有丝核DNA 不一致。有丝核DNA不一致可能破坏有丝核蛋白的物理和功能完整性，降低ETS复合物的电子传递能力，从而导致自由基增加，产生更高水平的活性氧，减少ATP的生成，并损害氧化呼吸过程，从而导致线粒体功能障碍。此外，有丝核DNA不协调也可以减缓mtDNA的复制效率或触发线粒体的重新融合以减轻功能障碍，最终减少mtDNA拷贝数(mtDNA-CN)和总呼吸能力。此外，可能观察到杂交适应度降低对生育能力、生存能力、发育和环境适应的不利影响， 正 如 Bateson-Dobzhansky-Muller (BDM)模型所解释的那样。已经提出了几种减轻有丝核不相容的潜在机制。

        有丝核共同进化假说表明，真核生物中线粒体和核基因组与适合度的共发生和相互作用受到选择驱动的相互进化变化的影响。参与线粒体功能的核基因的选择可以减少有丝核DNA的不一致性，从而维持有丝核的相容性。来自同一母本种群的核和mtDNA等位基因丰富的潮间带桡足动物Tigriopus californicus的杂交后代表现出更高的适应性。来自同一母源的核和mtDNA等位基因的富集符合BDM模型。然而，当线粒体核错配持续存在时，已经提出了一些补偿机制来维持线粒体功能。在mtDNA自适应渗入机制中，外来mtDNA等位基因可能具有较低的突变负荷或对环境具有更大的适应性，从而提高杂交后代的适应性。另一种选择是核补偿机制，表明新的核编码氨基酸序列或蛋白可能逆转或缓解有丝核功能障碍。核补偿机制的演变已经得到了几个物种的实证研究的支持以及仿真建模。然而，驱动核补偿机制的具体机制和因素仍不清楚，并存在争议。

        非洲土著瘤牛(如zebu、sanga和zenga)的特点是具有复杂的杂交历史，并伴有多波的渗入和迁移。两个不同的牛支系，无驼峰普通牛(B. taurus)和有驼峰zebu牛(B. indicus)起源于不同的原牛亚种(B. primigenius)，它们在距今(YBP)之前大约20万年至100万年分化。无驼峰的普通牛在新月沃地的驯化时间约为10000 YBP，其次是有驼峰的瘤牛在印度河流域的驯化时间约为8000 YBP。无驼峰普通牛在大约7000YBP首次被引入北非，随后在大约4000至3000YBP传播到西非和东非。有驼峰的zebu牛进入非洲的主要时间可以追溯到至少1400 YBP。今天所有非洲牛的mtDNA都是普通牛来源，而非洲瘤牛的Y染色体和常染色体主要是来自zebu。雄性性别偏倚的杂交被认为是当今非洲杂交牛的线粒体和核祖先之间差异的根源。

        最近的两项群体基因组研究表明，普通牛祖先在一些参与mitto - nuclear相互作用的核基因中富集，从而支持有丝核共同进化的假说。这两项研究没有探讨其他常染色体区域参与有丝核相互作用的前显性zebu祖先的可能解释。在此，我们剖析了多个非洲混合牛种群中功能性有丝核基因的进化过程，以评估有丝核DNA不一致的水平。然后，我们研究了祖先有丝分裂核兼容性存在或不存在的可能解释，并进一步揭示了非洲混合牛种群如何应对有丝分裂核不兼容性的潜在机制。

●结果

1.非洲杂交牛种群源种群的鉴定

        我们使用258头牛基因组的核心数据集进行种群基因组分析（附加文件1：补充表S1，在线补充材料）。无监督聚类描述了研究的非洲牛主要来自亚洲的zebu祖先的混合模式(Bos taurus×B.indicus）。这一结果得到了主成分分析(PCA)和最大似然(ML)树的支持(图1)。与先前研究结果一致，研究的非洲牛种群也显示出与非洲的遗传亲和力比欧亚的普通牛更接近的普通牛背景。因此，我们将非洲普通牛和亚洲zebu指定为非洲杂交牛种群的祖先供体种群。当地祖先推断表明，15个非洲杂交品种(n =150只动物)的核基因组中约有25%(不考虑性染色体)属于普通牛祖先（附加文件2：补充图S1，在线补充资料）。非洲zebu牛和普通牛的线粒体基因组均来源于普通牛（附加文件1：补充表S1，在线补充材料）。非洲牛的mtDNA被分配到普通牛亚单倍群T1，除了一个Arsi样本属于亚单倍群T2。我们计算了氧化磷酸化系统（OXPHOS)的13个线粒体基因的非同义与同义替换的比率(ω =dN/dS))，只有CYTB mt-基因在非洲牛的mtdna分支中显示了ω> 1。然而，似然比检验(LRT < 3.8415)不显著(P < 0.05，卡方检验)，不能支持非洲牛mtDNA序列的正选择。

图1 确定非洲杂交牛的潜在供体种群。 a)系统发育和Adimixture分析。 b)主成分分析。 对258份样本进行连锁不平衡修剪后，共分析了1,482,502个snp。 K表示admix分析中假设的祖先成分的数量。 CV error在K= 4时显著减小

2.表征有丝核基因(mitnuclear Genes)的祖先

        分析了四个基因亚群(图2a):(i)来自MitoCarta 3.0的与线粒体基因组相互作用相关的所有核基因(有丝核基因;n = 1,064);(ii)氧化磷酸化系统基因(OXPHOS基因;n=149)，它们直接参与了Signes和Fernandez-Vizarra组织的五个OXPHOS复合物的组装;(iii)具有与mtDNA复制和转录机制、核糖体功能和OXPHOS复合物相关功能的核基因(高mito基因;n=144);以及(iv)有丝核相互作用选择的候选基因(选择性基因;n=21)，据Kwon等人报道，这些基因参与细胞呼吸系统的完整性。与其他核编码基因和全基因组相比，我们观察到四个线粒体相关基因亚群的核苷酸多样性(π)显著降低(P<0.001)(图2b和附加文件2：补充图S2a，补充材料在线），表明这些线粒体相关基因处于强大的选择压力下。与全基因组背景相比，这四个基因组在两个祖先供体群体(即亚洲zebu和非洲普通牛)之间显示出显著更高的遗传分化(P < 0.001)(图2c)，支持有丝核基因比非有丝核基因进化速度更快的假设。因此，雄偏回交育种方案引入了zebu核祖先，但保持了普通牛的mtDNA(图2a)，增加了非洲杂交牛种群的核DNA不一致。

图2所示。 人介导的杂交形成了非洲杂交牛的异源mtDNA与核基因组之间的相互作用。 a)非洲杂交牛杂交简史和有丝核相互作用模式。 非洲牛是研究减轻有丝核DNA不一致影响的基因组机制以及了解次优有丝核组合下基因组相互作用的极好模型。 b)非洲杂交牛参与有丝核相互作用的四个基因集之间的核苷酸多样性（π）偏差。 c)亚洲zebu和非洲普通牛有丝核相互作用中四个基因组的遗传分化偏差。 由于独特的有丝核协同进化，亚洲瘤牛和非洲普通牛的混合可能引发有丝核DNA不一致。 50 kb基因组窗口中π的箱形图，滑动窗口为10 kb。 采用双侧t检验评价显著性(*，P<0.05； * *, P < 0.01; * * *, P < 0.001; * * * *, P < 0.0001; ns表示无统计学意义)。

      我们通过多种方法((Fdm，FST，RFmix和Loter)评估了非洲杂交牛种群基因组中有丝核基因的祖先，这些方法推断了当地祖先。结果显示，与全基因组相比，瘤牛祖先的有丝核基因、高丝核基因和OXPHOS基因亚群显著富集(P <0.01)(图3a和附加文件2:补充图S3和S4，补充材料在线)。与所有编码基因相比，一般在纯化选择下，大多数参与有丝核相互作用的基因在zebu祖先中表现出显著的富集(图3a和附加文件2:补充图S3和S4，补充材料在线)。随机重新采样表明，在有丝核基因亚群中，zebu祖先的富集可能是选择而不是遗传漂变的结果(附加文件2:补充图S2b至d，在线补充材料)。Kwon等人报道的选择性基因(n =21)显示出普通牛祖先的显著增加(P< 0.001)。9个基因的普通牛血统的平均比例低于平均25%(范围为0%至23.6%)(图3a和附加文件2:补充图S2和S5a，在线补充材料)。其余基因在普通牛祖先中的富集程度略高(>25%)(例如SLC30A6: 48.2%， TRAK2: 48.1%， CASP8: 41.7%)( 附加文件2:补充图S5，在线补充材料)。结果表明，通过对线粒体相关基因的选择，大多数与普通牛祖先有丝分裂核相互作用的基因在非洲混合牛的基因组中被消除(图b)。四种线粒体相关基因亚群的Tajima’s D分布向亚洲zebu供体群体转移(图3b)，这与杂交后基因组中形成本地祖先组合的选择模式是一致的。在来自东非、中非和西非种群的593个非洲混合牛基因组的扩展数据集中发现了类似的局部当地祖先偏差(图3a和附加文件2:补充图S6至S11，在线补充材料)和95个亚洲混合普通牛基因组(附加文件2:补充图S12c和d，在线补充材料)。

图3所示。 非洲杂交牛有丝核相互作用相关基因的祖先偏差。 a)非洲杂交牛本地祖先中涉及有丝核相互作用的基因之间的偏差。 FST、FdM和Loter的值使用50 kb的窗口大小和10 kb的步长来计算。 (*, P < 0.05; **, p <0.01； * * *, P < 0.001; * * * *, P < 0.0001; ns表示无统计学显著性)。 b)非洲杂交牛有丝核基因组（n= 1,064）、高丝核基因组（n=144）、OXPHOS基因组（n=149）和选择性基因组（n=21）的Tajima’s D估计密度图。 采用双侧t检验评价显著性。

3.非洲牛mtDNA-CN的核遗传控制

        我们根据基因组覆盖率估计了全血细胞中mtDNA-CN的数量。所有非洲牛的普通牛mtDNA-CN均显著低于欧亚牛（P<0.001）(附加文件2:补充图S13a，在线补充材料)。大多数非洲杂交牛品种的mtDNA-CN低于亚洲zebu(图4a)。有趣的是，当普通牛祖先在非洲牛种群中占全基因组的比例<25%时(n= 116)，我们观察到mtDNA-CN与普通牛祖先比例之间存在显著的负相关(图4b, R = -0.21, p值= 0.025)。mtDNA-CN在Barka、Kenyan Boran和Ogaden牛群中最高，普通牛血统最低(普通牛血统的平均比例<16%)。在这些种群中，mtDNA-CN水平与在亚洲zebu中观察到的相似(图4)。这种mtDNA-CN水平升高与线粒体核DNA不一致增加的模式也在亚洲混合普通牛中观察到(附加文件2:补充图S12e和f，补充材料在线)。非洲杂交牛(n= 116)的mtDNA-CN全基因组关联研究(GWAS)鉴定出148个全基因组显著(P< 1×10−7)位点(图5和附加文件1:补充表S3，在线补充材料，附加文件2:补充图S13e，在线补充材料)。它们累积解释了非洲杂交牛中85.9%的mtDNA-CN变异(图5和附加文件1:补充表S3，在线补充材料)。这些单核苷酸多态性(SNPs)映射到71个标记的蛋白质编码基因(附加文件1:补充表S3，在线补充材料)，但只有两个LYPLAL1和HARS2被包含在MitoCarta 3.0的有丝分裂核基因(n = 1,064)中。总体而言，与全基因组和所研究的有丝核基因的四个亚群相比，这71个基因在zebu祖先中的富集程度更高(图5b)。在这71个基因中，有14个与mtdna - CN、线粒体蛋白合成、ATP生成和线粒体功能相关(图5a和附加文件1:补充表S4，在线补充材料)。例如，先前报道ANKHD1和PHOSPHO1调节mtDNA-CN。这14个mtDNA-CN基因存在于非洲混合群体的选择性扫描特征中(附加文件1:补充表S5，在线补充材料，附加文件2:补充图S14，在线补充材料)。与来自MitoCarta 3.0的有丝核基因(n= 1,064)相比，这14个mtDNA-CN基因中有12个显示出更高水平的zebu祖先(图5c)。大约97%(143/148)的候选snp位于非编码区，可能具有调控功能(附加文件1:补充表S3，在线补充材料)。我们使用Cattle-GTEx对21个顺式eqtl进行了表征(附加文件1:补充表S6，在线补充材料)。两个顺式eqtlrs133309482和rs133946601可能调控CD14，它们参与线粒体功能和mitonnuclear相互作用(附加文件2:补充图S15a，在线补充材料)。这些结果表明，选择倾向于zebu祖先，而在mtDNA-CN相关基因中消除普通牛祖先，从而促进了非洲混合牛mtDNA-CN和线粒体功能的维持(图6和附加文件2:补充图S15b，在线补充材料)。

图4。 非洲牛mtDNA-CN与普通牛血统比例的相关性。 a)牛的普通牛血统与mtDNA-CN的比值。黑色实线表示每个箱线图的中位数，并作为链接。虚线表示25%的全基因组普通牛祖先水平（附加文件2：补充图S1，在线补充材料）。 b) 在全基因组血统<25%的群体中mtDNA-CN与非洲牛磺酸血统呈负相关（R= - 0.21， P=0.025）（n=116，图a中以红色突出显示）。

图5。 非洲杂交牛mtDNA-CN变异的遗传相关性。 a)采用GEMMA对非洲混合牛的mtDNA-CN变异进行GWAS，将其作为服从正态分布的数量性状（见附加文件2：补充图S13b，在线补充材料）。 基于基因组关系矩阵的遗传率为96.7%，表明血液mtDNA-CN具有较高的遗传性。 虚线表示显著性阈值1×10−7。 在与mtDNA-CN相关的71个编码基因中，曼哈顿图显示了14个参与mtDNA-CN调控、线粒体蛋白合成、ATP生成和线粒体功能的候选基因。 b)与mtDNA-CN相关的71个编码基因与全基因组或四个有丝核基因亚群的普通牛血统差异。 c)涉及线粒体功能、代谢、组装和mtDNA-CN的14个候选基因的普通牛血统偏差。 采用双侧t检验计算差异有统计学意义(*，P<0.05； * *, P < 0.01; * * *, P < 0.001; * * * *, P < 0.0001; ns表示无显著性)。

图6。 核补偿调和了非洲牛的核不相容。 性别偏倚的杂交被假定用来解释当今非洲驼峰牛的线粒体（B. taurus: 100%）和核（B. indicus: 75%）祖先之间的差异。 在非洲驼峰牛中，不断增加的有丝核DNA不一致是不可避免的，导致有丝核不相容。 因此，我们假设了三种情况：(i)选择下普通牛祖先（即mtDNA的来源）的富集减少了有丝核DNA的不一致性，称为有丝核共同进化机制； （ii）普通牛与瘤牛之间有丝分裂核基因高度保守，两者混合可能不会引发有丝分裂核不相容； 核基因的进化可能有助于逆转或减轻有丝核不相容，称为核补偿。 我们的研究结果表明，在强选择下，大多数参与核分裂相互作用的功能基因在非洲普通牛祖先中表现出显著的富集，不支持核分裂共同进化。 虽然丰富的zebu祖先增加了有丝核DNA的不一致性，但它促进了核补偿的进化。 来自亲本基因组的调控元件的不同活性对基因表达的调控主要产生较低水平的活性氧，减少氧化应激，减轻线粒体损伤，增加ATP的产生，维持mtDNA-CN，维持有丝核相互作用。

4.普通牛祖先富集的选择性基因

        我们进一步研究了被认为在普通牛祖先中富集的21个选择性基因。事实上，一些基因(如CASP8和TRAK2)在非洲普通牛祖先中表现出显著的富集(附加文件2:补充图S5，在线补充材料)。与其他线粒体相关基因数据集相比，这21个选择性基因普遍表现出更高的遗传多样性(图2b)，这意味着其中一些基因可能具有古老的遗传起源。然后，我们在普通牛起源群体的基因组中筛选了选择性扫描(Muturu和N 'Dama)(图7a)，发现一些基因(如CASP8和TRAK2)的选择可能先于与亚洲zebu的混合。含有CASP8和TRAK2的~ 2.2 Mb区域的ML树(chr2: 87,864,908至90,470,906)显示，非洲普通牛血统的谱系比欧亚普通牛血统的谱系分化程度更高(图7b)。我们进一步纳入了包括B. primigenius样本在内的古代DNA数据，以追踪该地区的起源。非洲普通牛祖先谱系显示出与来自摩洛哥的非洲野牛b.p.africanus Th7最强的遗传亲缘关系，同时显示出与其他非洲古代野牛和驯养牛样本的差异(附加文件2:补充图S16a，补充材料在线和附加文件1:补充表S7，补充材料在线)。ML树将非洲原牛B. p. africanus Th7定位在非洲普通牛祖先谱系的进化分支的基础上，表明可能来自古代非洲原牛的入侵。单倍型网络也揭示了非洲普通牛祖先谱系与非洲野牛Th7共享Hap 1(附加文件2:补充图S16b，补充材料在线）。此外，我们观察到非洲普通牛祖先谱系与非洲野牛b.p. africanus Th7具有更多的纯合snp(图7c)，并且与其他谱系相比，在含有CASP8和TRAK2的~2.2 Mb区域显示更高的等位基因频率(chr2: 87,864,908至90,470,906)(附加文件1:补充表S7，补充材料在线)。这些结果表明，现代非洲牛中某些富集非洲普通牛祖先的选定基因可能归因于来自古代非洲野牛的适应性渗入的遗传遗产。

图7所示。 普通牛富集基因的选择性扫描和系统发育。 a)对非洲普通牛品种Muturu和N 'Dama的21个基因进行选择性扫描。 虚线表示所有似然比值的前1%。 只显示似然值为>500的位点。 b)在chr2: 87,864,908 ~ 90,470,906基因组区域的ML树显示了非洲牛的古代适应性渐渗。 c) chr2基因组区与非洲野牛Th7共有纯合位点：87,864,908 ~ 90,470,906。 橙色和蓝色的点，以及连接线，分别代表非洲牛磺酸和欧亚牛磺酸祖先。 绿色的点和线表示与Th7共享的位点。

5.东亚牛的验证

        同样，我们研究了秦川牛和郏县红牛两个杂交品种东亚牛基因组中有丝核DNA的不一致性(附加文件1:补充表S8，补充材料在线)。我们首先关注了其中一个来自亚洲zebu的单倍群I样本，并发现FST和RFmix推断的本地祖先显示，与全基因组相比，MitoCarta 3.0 和OXPHOS基因的有丝核基因亚群中的普通牛祖先(而不是mtDNA来源)显著富集(P < 0.05)（补充图S12c和d，补充材料在线)。然后，我们注意到种群结构与mtDNA-CN之间的联系。与秦川牛相比，郏县红牛具有全基因组异质性(附加文件2:补充图S12a和b，在线补充材料)和地方祖先分布(附加文件2:补充图S12e，补充材料在线)，反映了秦川牛更严格的养殖实践和管理。秦川牛的mtDNA-CN高于郏县红牛(附加文件2:补充图S12f，在线补充材料)，支持mtDNA作为牛遗传改良的标记。在郏县红牛中，与单倍群I相比，mtDNA单倍群T样品的普通牛祖先比例(P < 0.01)和mtDNA-CN祖先比例(P < 0.05)显著高于单倍群I(附加文件2:补充图S12e和f，补充材料在线)。保留普通牛祖先增加了有丝核DNA不一致，但也可能增加mtDNA-CN。因此，杂交东亚牛基因组的有丝核DNA不一致和mtDNA-CN变异与非洲杂交牛基因组的模式一致。