作者，Evil Genius
高考了，翻开自己18岁的照片，真的是时光荏苒，从青葱少年变成现在的油腻大叔了，大家当初的梦想都实现了么？
AI与多组学，大家准备好了么？
这一篇我们分享文献，单细胞空间药理学。
知识积累
抗体疗法在多种疾病中效果显著，但临床成功率低（从1期到获批仅约10%），实体瘤缓解率仅约20%。
主要障碍在于：对治疗性抗体在人类肿瘤中如何分布（药代动力学，PK）、如何与其分子靶点结合（药效学，PD）以及受肿瘤微环境影响的方式缺乏了解。
现有工具（血浆检测、PET/SPECT成像）分辨率不足，无法在细胞水平研究肿瘤内的药物分布和作用；临床前模型无法完全模拟人类肿瘤的复杂性。
新方法：单细胞空间药理学
为应对上述挑战，作者开发了SSP框架，将系统性输注的治疗性抗体成像与高复合空间蛋白质组学相结合。
研究使用了pan800（荧光标记的EGFR靶向抗体）作为示踪剂，并搭配了针对细胞外基质、癌症相关成纤维细胞、肿瘤细胞、免疫细胞和血管的多种抗体组合。
结果1、SSP能够在完整的人类肿瘤微环境中，以细胞分辨率量化治疗性抗体的递送和活性
SSP（单细胞空间药理学）：对治疗性抗体进行荧光标记，在手术切除前静脉输注给患者，然后对切除的肿瘤组织进行多模式成像，从而在完整的人类肿瘤微环境（TME）中以单细胞分辨率量化抗体的递送和活性。
肿瘤间及肿瘤内的药物浓度高度异质性：
比较不同癌种，胰腺导管腺癌（PDAC） 的肿瘤内抗体浓度显著低于头颈部鳞状细胞癌（HNSCC） 和非小细胞肺癌（NSCLC），可能与其致密纤维化基质有关。
即使在HNSCC内部，患者间的药物浓度差异也很大（可相差数倍），表明HNSCC中也存在药物递送障碍。
药物递送与靶点抑制相关：
肿瘤内pan800（标记的抗EGFR抗体）的浓度与EGFR的磷酸化水平（pEGFR，代表靶点活性）呈显著负相关。即药物递送越高的区域，EGFR通路抑制越明显，证明了SSP能有效评估药物的药效学效应。
SSP能够精确定位药物结合部位：
通过将pan800图像与高复合空间蛋白组学（CODEX）图像精确对齐（配准误差在亚微米级别），可以在单细胞水平上观察药物分布。
意外发现：CD11b⁺髓系细胞（如某些巨噬细胞）中的抗体信号强度显著高于肿瘤细胞本身，并且在多名患者中重复验证。这表明髓系细胞可能在肿瘤内抗体的分布和暴露中扮演重要角色（可能与吞噬或Fc受体结合有关）。
技术稳健性：
使用深度学习模型MESMER对富含成纤维细胞的致密基质区域进行单细胞分割，其精度与人工专家标注高度一致（F1分数>0.81），保证了后续分析的可靠性。
pan800成像在不同批次的组织切片间具有高度可重复性。
SSP提供了一个强大的框架，能够在完整人类肿瘤组织中，以前所未有的空间分辨率（单细胞、亚细胞水平）同时测量药物分布（药代动力学）、靶点结合（药效学） 和肿瘤微环境结构。应用该技术揭示了肿瘤内药物递送存在显著的空间异质性，并发现髓系细胞是抗体积累的重要位点。
结果2、单细胞水平的抗体-药物靶点结合与HNSCC中的靶细胞状态及空间拓扑结构相关
在HNSCC中，大部分肿瘤细胞（约78.5%）要么不表达EGFR靶点，要么表达靶点但未被抗体结合（其中EGFR⁺pan800⁻占35.9%，EGFR⁻pan800⁻占42.6%）。仅有16.6%的肿瘤细胞同时表达EGFR并被抗体结合。
药物-靶点结合具有空间分布规律：
结合位点屏障效应：发生有效结合（EGFR⁺pan800⁺）的肿瘤细胞主要位于肿瘤巢的边缘（靠近血管），而表达靶点但未被结合的细胞（EGFR⁺pan800⁻）则更多地分布在肿瘤巢的核心区域。这验证了经典假说：高亲和力抗体在遇到抗原表达阳性的外围细胞时会被“滞留”，难以穿透到肿瘤深处。
肿瘤细胞状态决定药物结合效率：
高结合状态：处于部分上皮-间充质转化（pEMT，PDPN⁺） 和增殖（Ki67⁺） 状态的肿瘤细胞，其抗体结合水平最高，并且这些细胞优先位于肿瘤巢外周。
低结合状态：处于缺氧（CAIX⁺） 状态的肿瘤细胞，其抗体结合水平最低。这与缺氧区域血管功能异常、药物难以到达的生物学特征一致。这些细胞更多地位于远离肿瘤巢边缘的内部。
在HNSCC中，治疗性抗体（pan800）能否有效结合其靶点（EGFR），不仅取决于靶点表达量，更高度依赖于肿瘤细胞的功能状态（增殖、缺氧、pEMT）及其在肿瘤组织中的空间位置（边缘 vs. 核心）。SSP技术通过将单细胞状态、空间拓扑结构与药物结合信息相整合，揭示了“结合位点屏障”和缺氧微环境是限制抗体药物渗透和靶点结合的关键因素，为理解耐药性提供了新的空间维度视角。
结果3、富含骨膜蛋白的细胞外基质与HNSCC中抗体穿透能力降低相关
骨膜蛋白（Periostin）富集的ECM是阻碍抗体药物穿透HNSCC的关键物理屏障
ECM蛋白的空间分布异质性：
不同的ECM蛋白（如胶原I、骨膜蛋白、纤维连接蛋白等）在肿瘤基质中具有不同的分布模式。骨膜蛋白表现出独特的肿瘤周围和血管周围定位。
骨膜蛋白是唯一与药物分布显著负相关的ECM成分：
在分析的五种ECM蛋白中，只有骨膜蛋白的密度与肿瘤内pan800（药物）强度呈显著负相关。即骨膜蛋白越多，药物越少。
识别出四种ECM邻域（Neighborhoods）：
通过空间分析，定义了四种不同的ECM微环境。其中ECM2（富含骨膜蛋白、胶原I和纤维连接蛋白）蛋白密度最高，被认为是物理限制性最强的结构；ECM1（富含胶原I和骨膜蛋白）常直接包裹肿瘤细胞。
ECM屏障阻碍药物递送的两个层面：
血管周围屏障：血管周围ECM2的频率越高，肿瘤细胞摄取的药物越少。富含骨膜蛋白的ECM与血管面积减小相关，暗示其可能压迫或改变血管，减少药物从血液外渗。
肿瘤周围屏障：被致密ECM1包裹的肿瘤细胞，其药物水平更低。并且这些ECM1富集区域同时含有更多的缺氧（CAIX⁺）肿瘤细胞，形成“缺氧-致密基质-药物难以到达”的恶性循环。
结论与意义：
富含骨膜蛋白的ECM聚集体是限制抗体药物穿透HNSCC的重要空间屏障。SSP技术首次在单细胞、空间尺度上将特定ECM结构与药物递送障碍直接关联，为未来通过靶向基质（如降解骨膜蛋白或相关基质）来提高抗体药物在实体瘤中的疗效提供了理论依据。
结果4、FAP+ 癌症相关成纤维细胞与HNSCC中富含骨膜蛋白的ECM增加及抗体递送减少相关
CAF是ECM蛋白的主要生产者，并已被证明能够调节癌症进展和治疗反应。
主要CAF亚型：在HNSCC中，最主要的两种CAF亚型是 FAP+ CAF 和 FAP+CD73+ CAF。
细胞邻域分析
目的：系统性地绘制CAF及其与TME其他成分（如血管、肿瘤细胞、免疫细胞）的空间互作模式。
方法：
为每个细胞定义一个包含其自身及最近邻的n个细胞的窗口。
对窗口内各细胞类型的频率进行无监督聚类。
通过比较不同窗口大小（5-25个最近邻细胞），选择能最优分离不同功能区域（如肿瘤区、血管相关区、FAP+成纤维细胞区）且避免过度平滑的窗口（本研究中选择了9个细胞作为窗口大小）。
产出：识别出10种细胞邻域，包括肿瘤CN、血管富集基质CN、成纤维细胞CN（分别富集FAP+ CAF和FAP+CD73+ CAF）以及多种免疫细胞CN。
高阶多细胞结构分析
目的：评估不同细胞邻域之间的相互作用如何影响药物-靶点结合和ECM组织。
方法：
提取每个细胞周围180个最近邻细胞作为窗口。
筛选出窗口内主要由特定CN（如肿瘤-基质界面CN6、血管富集CN1、以及FAP+或FAP+CD73+基质CN5/CN9）构成的细胞。
将这些CN的组成投影到重心坐标系中。
产出：在重心坐标系中，顶点、边和中心分别代表窗口由单一CN、两种CN混合或三种CN混合构成的细胞。通过分析细胞在坐标系中的分布，发现了肿瘤-血管界面（CN6-CN1组合）与高药物水平正相关，而肿瘤-血管-FAP+CD73+ CAF（CN6-CN1-CN9组合）与低药物水平负相关。
空间相关性分析
目的：将特定细胞类型（CAF亚型）与特定的ECM结构（ECM1/ECM2）和药物水平直接关联。
方法：
计算血管周围特定CAF邻域（如CN9, FAP+CD73+基质）的频率与ECM2（骨膜蛋白、胶原I、纤维连接蛋白）富集度的Pearson相关系数。
计算肿瘤周围特定CAF邻域（如CN5, FAP+基质）的频率与ECM1（胶原I、骨膜蛋白）富集度的Pearson相关系数。
对所有相关性分析进行Benjamini-Hochberg多重假设检验校正。
产出：发现CN9与ECM2呈显著正相关，CN5与ECM1呈显著正相关，并且这两种ECM结构都与更低的药物水平相关。
敏感性分析
目的：验证核心发现（如肿瘤-FAP+基质界面与药物水平负相关）对分析参数选择的稳健性。
方法：在不同空间上下文窗口大小（k = 100, 140, 180, 220, 260个最近邻）下，重复计算肿瘤-FAP+基质界面的频率与平均肿瘤pan800水平的相关性。
产出：在所有测试的窗口大小范围内，均观察到一致的负相关（Pearson r ≈ -0.34 至 -0.40, P < 0.05），证明该发现是稳健的，不依赖于特定参数选择。
外部转录组数据验证
目的：在转录组（mRNA）水平验证CODEX（蛋白水平）发现的CAF亚型和相关基因表达特征。
方法：
分析公开的HNSCC单细胞RNA测序数据集。
鉴定CAF亚型，并比较不同亚型之间ECM相关基因和ECM修饰酶基因的表达差异。
产出：确认了FAP+ CAF和FAP+CD73+ (NT5E+) CAF是主要亚型，并发现FAP+ CAF表达更高水平的POSTN（骨膜蛋白）、TNC、多种胶原及LOXL2、MMP等基质重塑酶基因，支持其作为ECM屏障构建者的角色。
空间转录组学分析
目的：在空间维度上探索与药物递送高低相关的分子通路。
方法：对部分HNSCC患者进行基于区域的空间转录组学（GeoMx DSP平台） 分析，并比较药物高递送与低递送患者之间的通路富集差异。
产出：在药物高递送患者中，ECM降解通路和EGFR下调通路显著富集。
结果5、富含骨膜蛋白的ECM和FAP+ CAF构成一个保守的基质微环境，与PDAC和HNSCC中抗体递送减少相关
跨肿瘤类型的保守性屏障
共同屏障成分：在PDAC和HNSCC中，骨膜蛋白均是唯一与肿瘤内药物水平呈显著负相关的ECM蛋白，表明它是实体瘤中抗体穿透的保守性物理屏障。
共同细胞来源：FAP+ CAF 是两种肿瘤中最主要的成纤维细胞亚型。在两种肿瘤中，肿瘤周围的FAP+ CAF都与富含骨膜蛋白的ECM（ECM2/pECM2）形成正相关，并都与较低的药物水平相关。
PDAC特异性发现（与HNSCC对比）
更显著的ECM屏障：PDAC中I型胶原、骨膜蛋白等ECM蛋白的丰度显著高于HNSCC，这与PDAC中整体药物浓度更低（图1d）和纤维化程度更高（成纤维细胞:肿瘤细胞比例约为2:1，而HNSCC约为1:3）相一致。
更高的CAF亚型多样性：PDAC中的CAF亚型比HNSCC更多样（包括FAP+、CD90+、PDGFRβ+、αSMA+四种主要亚型），但FAP+ CAF依然是最主要的群体。
特定屏障结构：在PDAC中，pECM2（骨膜蛋白+I型胶原）邻域的富集与药物摄取呈强烈负相关，且pECM2与肿瘤周围的FAP+ CAF（pCN10）呈强烈正相关，进一步巩固了FAP+ CAF → 骨膜蛋白丰富ECM → 药物屏障这一轴线。
多平台验证
空间转录组学（Xenium）验证：独立的空间转录组学分析在两种肿瘤中均证实：肿瘤pan800强度与肿瘤邻近FAP+ CAF中的POSTN（骨膜蛋白）基因表达以及肿瘤邻近FAP+ CAF的丰度呈负相关。这为蛋白质组学发现提供了正交的、单细胞水平的转录组证据。
结论与意义
保守的耐药微环境：研究揭示了一个在HNSCC和PDAC中保守存在的基质微环境：FAP+ CAF 通过沉积和重塑以骨膜蛋白为核心的致密ECM，形成物理屏障，限制抗体药物向肿瘤内部的穿透。
治疗启示：这些发现为开发新的联合治疗策略提供了强有力的理论依据，即通过靶向FAP+ CAF或降解骨膜蛋白来“软化”基质屏障，从而提高现有抗体药物在实体瘤（尤其是基质丰富的PDAC）中的递送效率和治疗效果。
最后，来看看方法
