线粒体失衡在DCM中发挥重要作用。DCM与线粒体动态变化紧密相关，包括线粒体的分裂和融合。
线粒体分裂受到mitochondrial dynamic proteins的调控，包括Fis1 (mitochondrial fission 1), Drp1 (dynamin-related protein 1)和 Mff (mitochondrial fission factor)。而线粒体融合主要被 Mfn1 (mitofusin-1), Mfn2 (mitofusin-2), and Opa-1 (optic atrophy 1)所调控。
过度的线粒体分裂被认为是有害的，因其会导致线粒体数量增多但体积下降，从而导致大量broken线粒体，大量ROS的产生，和线粒体功能失衡。另一方面，Mfn2可以通过促进线粒体融合消除线粒体功能失衡，减轻心脏疾病进展。

泛素化在调节胞内蛋白稳态和酶活性中起到重要作用。去泛素化酶通过移除肽段上的泛素来消除E3连接酶的作用，在泛素化的稳态调节中起到重要作用。人类中大约鉴定出了100种去泛素化的酶，主要分为两大类：半胱氨酸蛋白酶cysteine proteases 和 金属蛋白酶metalloproteases。半胱氨酸蛋白酶包括泛素c端水解酶UCH (ubiquitin C-terminal hydrolase), 泛素特异性蛋白酶USP (ubiquitin-specific protease), 卵巢肿瘤样蛋白酶OTU (ovarian tumor-like proteases) 和 Machado-Jakob病蛋白酶。本文中的USP28就属于USP家族。

1. USP28 Expression Is Markedly Downregulated in the Diabetic Heart and Correlates With DCM Progression

小鼠心脏：作者首先分析了db/db和db/m鼠的左室组织的RNAseq，以寻找调节疾病进展的关键分子。GO结果显示ubiquitin-mediated proteolysis通路被显著富集(附图)。因此作者查看了差异性的deubiquitinating enzymes，得到了5个上调基因和11个下调基因。在下调基因中USP28最为显著(a)。wb和免疫荧光结果同样显示了db鼠心脏组织中USP28的下降(b, c)。
人的样本：在糖心患者心脏组织中同样发现了USP28的下调(d, e)，且USP28阳性区域的面积与BNP mRNA的水平负相关(f)。wb和qpcr也显示糖心患者心脏USP28显著下降(g, h)。
体外实验：接着作者使用葡萄糖和棕榈酸酯(HG+PA)干预大鼠乳鼠原代心肌24h，来模拟高糖高脂环境。体外实验同样显示，与低葡萄糖LG组相比，HG+PA处理的NRVMs的USP28表达显著更低(i-k)。附图中作者还做了hiPSC-CMs，也得到了一致的结果。

2. Restoration of Cardiac USP28 Ameliorates Cardiac Remodeling and Dysfunction in the Diabetic Heart

接着作者用rAAV9-cTnT-USP28特异性过表达了小鼠心肌细胞中的USP28，发现过表达USP28的db小鼠心脏收缩功能改善(a, b)，E/A和E/E'均改善(c-f)，提示USP28可以改善db小鼠心脏收缩舒张功能。形态学检测发现USP28可以改善db小鼠扩大(g-h)，HE和WGA染色同样提示心脏体积减小(i-j)。db小鼠的心脏纤维化也减轻(k-l)。

3. USP28 Impedes Lipid Accumulation and Reverses ROS Production, Mitochondrial Dysfunction

为了探究USP28如何引起心脏重塑和失代偿，作者对rAAV9-USP28 和 rAAV9-null–treated db/db小鼠左室组织进行了RNAseq。GO结果显示代谢和线粒体通路被显著富集(附图)。因此作者对脂肪含量和线粒体形态进行了检测。油红染提示USP28过表达可以减轻心脏脂肪沉积(a-b)，心脏中的脂滴也减少(c-d)。24周的db/db鼠心脏存在显著的线粒体嵴损伤，USP28的过表达没有影响线粒体形态，但是降低了嵴损伤线粒体的比例(e-f)，ATP产生也增加(附图)。接着作者使用WB检测了线粒体融合与分裂。db鼠心脏的Mfn1下降，Drp1和Drp1^S616上调，提示分裂增加。而过表达USP28后，Mfn1上调，Drp1和Drp1^S616下降(g-h)。在大鼠乳鼠心肌细胞中，24h的HG+PA处理引起了线粒体的碎片化和肿胀，而这个现象被USP28过表达部分挽救(h-j)。ATP production–coupled, 和 maximal oxygen consumption rate (OCR) 也改善(k-l)。

4. Cardiac-Specific USP28 Deletion Aggravates Diabetic Heart Failure and Mitochondrial Dysfunction

接着作者构建了心肌特异性USP28敲除鼠 (USP28-cKO)，发现USP28 cKO db/db 鼠比USP28-flox db/db 的LVEF更低，E/A更高，心肌肥厚更重，心脏脂肪沉积和线粒体损伤也更重。

5. USP28 Specifically Interacts With PPARα to Modulate Deubiquitinated Modification and Stability of PPARα

为了明确可以调节脂质代谢和线粒体功能的USP28去泛素化底物，作者进行了IP-MS，得到了226个可能与USP28结合的蛋白。其中PPARa丰度很高(附图)。此外，在PPAR家族中，只有PPARa可以与USP28结合(a-b)。纯化蛋白的体外pull down实验也证实USP28可以直接与PPARa结合(c)(参考：Co-IP、GST pull-down如何区分)。在患者心脏组织中作者也证实了PPARa与USP28的互做(d)。在NRVM中，与control相比，HG+PA–treated NRVMs中PPARa与USP28的互做下降(e)。免疫荧光同样显示 NRVMs中PPARa与USP28存在共定位(f)。接着作者通过截短明确了两者结合的结构域(g, h)。
作为去泛素化酶，USP28可能可以调节PPARa的翻译后修饰。为了探究USP28是否去泛素化并stabilizes PPARa，作者随后通过deubiquitination assay 评估了PPARa的多聚泛素化水平，发现USP28显著促进了体内PPARa的去泛素化水平(i)。在USP28敲低的细胞中，PPARa的泛素化水平显著上调(j)。另一方面，在HEK293细胞中，USP28过表达对PPARa的去泛素化作用在USP28酶活性突变质粒中消失(k)。
最后作者使用cycloheximide (an inhibitor of protein translation)处理了NRVM细胞，并评估了PPARa的水平。发现与control相比，USP28的沉默显著降低了PPARa蛋白的半衰期(l)，而在Ad-USP28 感染的NRVMs中，PPARa蛋白的半衰期上升(m)。这些结果提示USP28可以特异性结合并发挥去泛素化作用从而stabilize PPARα。

6. USP28 Regulates Mitochondrial Homeostasis by Promoting PPARα-Mediated Mfn2 Transcription in Cardiomyocytes

与IP结果一致，RNAseq富集结果也显示线粒体代谢通路尤其是PPAR通路被显著富集(a)。接着作者使用免疫荧光检测了PPARa的细胞定位，发现主要定位在胞核(b)。而且在HG+PA–treated NRVMs中，USP28促进了PPARa的核转位(c)。由于PPARa是转录因子，作者接着使用了ChIP-seq在hiPSC-CMs中检测了PPARa结合的区域。结果显示PPARα peak相关基因在线粒体片段、ATP产生、脂肪代谢等通路显著富集(d,e)。由于Mfn2主要富集在线粒体且在线粒体融合中发挥重要作用，作者挑选了Mfn2做进一步的验证(f)。ChIP证实了PPARa与Mfn2启动子区的结合(g)。在糖心患者心脏中，USP28与MFN2的mRNA水平呈显著正相关(h)。ChipSeq结果显示PPARa主要结合在Mfn2启动子-882 to -862 bp处(i)，荧光报告基因验证了这个结果(j, k)。

7. Ablation of PPARα Largely Abrogates USP28- Induced Cardioprotective Benefits in db/db Mice

接着作者探究了PPARa是否是USP28对心脏重塑、脂质沉积和线粒体失衡的保护作用所必须的。作者构建了PPARα knockout db/db mice (PPARα–/– db/db mice)，并使用rAAV9-cTnT-USP28过表达USP28。结果显示USP28改善了db鼠的心功能恶化的效应在PPARα–/– db/db鼠中消失。对脂质沉积和线粒体损伤的保护作用也消失。体外细胞实验也得到了一致的结果。

8. Loss-of-Function of Mfn2 in Cardiomyocyte Abolishes USP28 Reconstruction-Induced Cardioprotection in db/db Mice

与上一部分一样，作者接着通过 Inducible cardiac-specific Mfn2 (Mfn2 cKO) deficient
db/db mice (db/db-Myh6MerCreMer/Mfn2fl/fl)敲出了Mfn2，并使用rAAV9-cTnT-USP28过表达USP28。同样发现USP28对db小鼠的心脏和线粒体保护作用在敲除Mfn2后消失(附图)。

9. Restoration of Cardiac USP28 Counteracts Diabetic Heart Failure and Mitochondrial Disarrangement in HFD/STZ-Induced Type 2 Diabetes Mice。

为了评估DCM中USP28 restoration的作用，作者使用HFD/STZ构建了另一种2型糖尿病小鼠模型。在小鼠6周大时，给予STZ/HFD之前，使用rAAV9-cTnT-USP28过表达USP28。发现USP28过表达不影响小鼠基础心功能但显著缓解了糖尿病心脏的收缩和舒张功能(a-b)，增大的小鼠心肌细胞缩小(c)，心脏纤维化面积也下降(d)。小鼠心脏脂质沉积(e-f)和线粒体脊损伤也减轻(g-h)。Taken together, all these results suggested that restoration of cardiac USP28 counteracts diabetic heart failure and mitochondrial morphofunctional defects in HFD/STZ-induced type 2 diabetes mice.

The present study presented evidence supporting the role of mitochondrial homeostasis in controlling structural and metabolic remodeling in DCM by identifying USP28 as a potential regulator of diabetic hearts. The results of this study demonstrate that downregulated USP28 expression in cardiomyocytes in the diabetic heart disturbs the lipid metabolism and mitochondrial function, together with PPARα-Mfn2–mediated mitochondrial fusion, signaling is impeded. However, restoration of USP28 by the AAV approach promotes the deubiquitination of PPARα to stabilize PPARα, therefore triggering Mfn2 transcription and mitochondrial homeostasis, ultimately improving cardiac remodeling and dysfunction in DCM.