基因表达量的衡量指标有:RPKM、FPKM、TPM。
RPKM:Reads Per Kilobase Million=Reads Per Kilobase Per Million Reads,即每一百万条Reads中,对基因的每1000个Base而言,比对到该1000个base的Reads数。
R1=map到该基因的reads总数
L1=该基因长度
RT=map到基因组的总reads数
FPKM:Fragments Per Kilobase Million=Fragments Per Kilobase Per Million Reads。
F1=map到该基因的fragments总数
L1=该基因长度
FT=map到基因组的总fragments数
FPKM与RPKM的区别仅在于,Fragment 与 Read。
RPKM的诞生是针对早期的单端测序,FPKM则是在双端测序上对RPKM的校正。
Reads即是指下机后fastq数据中的每一条Reads,Fragments则是指每一段用于测序的核酸片段。
在单端测序中,一个Fragments只测一条Reads,所以,Reads数与Fragments数目相等;
在双端测序中,一个Fragments测两端,会得到2条Reads,但由于后期质量或比对的过滤,有可能一个Fragments的2条Reads最后只有一条进入最后的表达量分析。
总之,对某一对Reads而言,这2条Reads只能算一个Fragments,所以,Fragment的最终数目是Reads的1到2倍之间。
TPM:Transcripts Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts)。
TPM的计算分3步:
step1:根据基因/转录本长度校正count值;假设某基因count值为R1,则校正后count值为:
R1/(L1/1000) : L1为该基因的长度;为什么要除以1000,是因为基因长度要按照kb计算
step2:计算total 校正后count值;即所有基因的校正后count值总和,Rtotal;再除以1百万(1000000)。
step3:计算TPM;TPM结果为: