Tumor cell-intrinsic epigenetic dysregulation shapes cancer-associated fibroblasts heterogeneity to metabolically support pancreatic cancer

Mitochondrial OXPHOS is activated in SETD2-deficient pancreatic tumors

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作者这儿首先对TCGA-PAAD 和 QCMG-PAAD 数据集进行了基因集富集分析（QCMG：昆士兰医学基因组学中心）
无论TP53的突变情况，SETD2 突变伴KRAS 突变表现出OXPHOS（氧化磷酸化）的显着富集
在针对STED2表达差异的GSEA分析中，也是OXPHOS富集

这儿找了两种小鼠，KC鼠是LSL-KrasG12D和Pdx1-Cre两种基因型，KSC鼠是LSL-KrasG12D和Pdx1-Cre加Setd2 f/f三种基因型。
针对KC鼠和KSC鼠进行单细胞，测出来六个簇，分别是：
腺泡和导管细胞、内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、中性粒细胞以及 T 细胞和 NK 细胞

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因为是胰腺导管癌，所以这儿先进一步剖析腺泡/导管细胞的细微差异，作者将这簇细胞重新聚类为 5 个亚群（图D、E、F）
第一簇是：表达 Amy2 和 Prss1 标志物的腺泡细胞，占主导地位，占细胞的一半以上
第二簇是：腺泡-导管化生 （ADM），共表达的腺泡和导管标志物（Press1、 Krt19 和 Epcam ）的亚簇
第三簇是：仅表达导管标志物的簇，这儿进一步划分为三个亚簇，（都表达导管标志物，Sox9、Krt19、Epcam，量不同）
拟时序分析显示，整体演化轨迹也是从Acinar往Ductal的一个过程（图G）
进一步分析不同亚簇在KC和KSC的情况，其中Ductal 3主要来自于KSC（图H）
进一步看通路富集情况，炎症反应、脂质代谢过程、OXPHOS和细胞分化在导管#3明显富集（图I）
同时看了一下相关因子的情况，干性相关转录因子（TF，例如 Klf4 、 Klf5 和 Gata5 ）、上皮-间充质转化 （EMT） 相关 转录因子 Twist1 和脂质代谢调节因子 Pparg 富集在导管 #3 中富集（图J）
进一步进行GSEA分析证实了KSC中导管恶性细胞的OXPHOS和脂肪酸代谢的富集（图K）
表现出来就是KSC的耗氧率（OCR）增加（图L）

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已经确定了Stet2和OXPHOS富集相关，这儿进一步去看在模型中的情况。
在细胞中，作者应用OXPHOS抑制剂Gboxin，结果显示KSC肿瘤尺寸缩小更明显。（图A）
进一步看了一下膜电位情况和干性相关TF的情况，结果显示KSC的膜电位更高，干性更强，在Gboxin处理后降低更明显。（图B、C）
这儿想进一步验证KSC的一个情况，所以这儿就用了KSC小鼠模型
在KSC小鼠模型中，应用了体内药物制剂s-Gboxin，结果基本一致。小鼠肿瘤大小缩小，肝转移减少，生存边长（图D-G）
同时，OCR情况说明s-Gboxin对小鼠荷瘤的OXPHOS具有显著抑制。（图H）
进一步看Sted2敲除的肿瘤，结果显示，对于药物显著抑制这类肿瘤的生长，延长了生存期，抑制了OXPHOS。（图I-K）

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那么进一步深入探索代谢的细节，葡萄糖、谷氨酰胺和脂肪酸都是线粒体的呼吸底物，所以这儿就想看看OXPHOS升高和哪一个底物相关。
这儿用了三种药物去处理 分选出来的Setd2WT 和 Setd2KO 细胞，分别是UK-5099（线粒体丙酮酸载体，MPC抑制剂），BPTES（谷氨酰胺酶抑制剂），Etomoxir（肉毒碱棕榈酰转移酶1A，CPT1α抑制剂）
结果显示，Setd2KO PDAC 细胞的基础 OCR 呼吸被 Etomoxir 显着抑制（图A）
在小鼠体内实验中 ，所有抑制剂都减少了 Setd2 ko 肿瘤生长，其中 Etomoxir 作用最显著。（图B）
这说明作者推测这类细胞主要是通过脂肪酸 β-氧化 (FAO) 来维持 OXPHOS
既往认知中，正常胰腺和胰腺肿瘤都不富含脂质，但作者发现原位 Setd2 KO肿瘤中存在大量脂肪细胞样细胞（图C）
多重免疫荧光提示 脂滴 (LD) 上的周脂蛋白 1 (PLIN1) 和周脂蛋白 2 (PLIN2) 水平升高，同时，这些 LD 阳性细胞主要与泛 CAF 标记足平蛋白 (PDPN) 共染色，但较少与 CK19（胰腺肿瘤细胞标记）共染色（图D）
所以作者认为，表明这些 LD 阳性细胞主要是 CAF，
与 Setd2 WT 肿瘤相比，来自Setd2ko 肿瘤中的PDPN + 细胞包含中性脂质（以 BODIPY 表示）（图E）且细胞内甘油三酯 (TG)、非酯化脂肪酸 (NEFA) 和胆固醇升高（图F）
因此这儿，作者得出结果：Setd2 的缺失会诱导富含脂质的基质的形成，可能作为肿瘤细胞中维持 FAO-OXPHOS 的能量来源。

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进一步的，作者探索了富含脂质的基质增加的起源，这儿进一步对之前单细胞的CAF部分进行分析，分为4簇（图A）
其中C3在KC肿瘤中普遍存在，而C2在KSC肿瘤中占主导地位（图B）
拟时序分析鉴定了 C3 和 C2 的不同进化轨迹（图C）
进一步分析（图D）
C1 亚群显示出类似于 inflammatory fibroblast (iCAF) 的转录组学特征
C2中富集最多的标记基因是 Abca8a 、 Cxcl14 和 Lpl
C3 CAFs表现出myofibroblast (myCAF)特征，Mfap4 、 Col1a1 和 Col1a2
进一步进行GSEA， C3主要是富集到氧化磷酸化、缺氧和胶原纤维组织途径，进一步证实了它们与 myCAF 的相似性
C2特征基因显示出与ABC转运蛋白和脂肪生成相关的不同转录组，表明脂质代谢特征（图E）。

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接着就看不同肿瘤里的CAF情况，多重免疫荧光提示，Acta2 （编码α-SMA）表达特异性存在于C3 CAF中，而 Fap 和 Abca8a 主要存在于C2 CAF中（图F）
进一步看KSC、KC和KPC中的表达情况
α-SMA + CAF 在 KSC 肿瘤中表达较少，Fap+ CAF 在KSC 肿瘤中显着增加，且位于导管肿瘤细胞附近，而在 KC、KPC 和 KSC 肿瘤中，PDPN+ FAP− α-SMA- CAFs（除了上述两种的其他CAF） 位于肿瘤细胞的远端（图G-H）
总的来说，具有脂质代谢转录组特征的C2 CAF主要位于KSC肿瘤中，其独特的空间分布表明它们可能与肿瘤细胞有密切的相互作用。

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因为C2富集到脂质相关通路，且KSC中富集，作者进一步的验证了是不是C2 CAF导致了 KSC中的脂质堆积。
这儿用PDPN+ ABCA8a+ FAP+ 来筛选C2 CAF，并且用PDPN+ ABCA8a− FAP-作为对照
结果显示，KSC中的C2 CAF明显更多，且含有更多的中性脂质，以及更丰富的细胞内 TG （甘油三酯）和 NEFA（血清游离脂肪酸）（图I-K）
总结一下这儿就是论证了Setd2缺陷的肿瘤具有富含脂质表型的C2 CAF

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现在就要进一步去看CAF和合富含脂质环境的关系
CAF 的异质性是由来自遗传多样性肿瘤细胞和 TME 的多种线索决定的，其中来自肿瘤细胞的信号被认为是主要影响的因素，所以这儿就往信号通路去看了。先前的一项研究强调肿瘤细胞固有的 TGFβ 和 IL-1/JAK/STAT3 信号传导分别是 myCAF 和 iCAF 形成的主要途径。
所以这儿就想看一下CAF细胞和导管细胞间的通讯情况，结果显示BMP 信号传导是关键因素（图A）。
BMP2 表达在Ductal 3中占主导地位，并与 C2 CAF 中的受体表现出强烈的相互作用，另外，C2 CAF 表现出升高的 BMP4 水平，并表现出显着的 BMP4 配体-受体相互作用。（图右上角）
综上，结果怀疑表明Setd2 缺陷的胰腺肿瘤旁分泌 BMP2 信号从导管细胞到 CAF，还会自分泌 BMP4 信号传导
那么既往研究报道了， BMP2 和 BMP4 可诱导肌成纤维细胞反式分化为脂质储存细胞
在 Setd2ko的条件培养基 （CM） 中培养主要 CAF 祖细胞、胰腺星状细胞 （PSC） 和骨髓间充质干细胞 （BMSC） ，结果显示显示脂质载量表型和脂质相关基因表达上调（图DE）。
用中和抗体阻断BMP2可有效防止暴露于Setd2ko的CM中的PSC的脂质积累 （ 图FG）。

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为了进一步研究 BMP2/BMPR 轴在富含脂质的 ABCA8a+FAP+ CAFs 形成中的作用
这儿在小鼠体内沉默 了Bmp2
Setd2KO-shBmp2 PDAC细胞的CM中的PSCs的脂质储存显著降低（图I）
同时，Bmp2 沉默显着减少了Setd2KO肿瘤的进展，伴有ABCA8a+FAP+ CAF减少（图IJ）
总的来说，这些发现强调了BMP2/BMPR1a轴在促进CAFs富脂表型和影响 Setd2KO PDAC的整体增殖

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最近的研究揭示了 CAF 在提供氨基酸、核苷和外泌体以滋养肿瘤细胞方面的作用。
在空间上，我们观察到KSC中富含脂质的CAF与恶性细胞之间的密切相互作用（前文图GH）
因此就想看看，富含脂质的CAF是否将脂质转运到肿瘤细胞中以支持其OXPHOS和生长
通过离体脂质脉冲追踪测定（图A），作者发现Setd2缺失肿瘤中分离的 CAF 能够更有效地将更多的荧光长链脂肪酸（LCFA、BODIPY-C16）转移到肿瘤细胞中（图BC）

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这儿作者为了进一步探索脂质转移的机制，去集中研究了前面C2 CAF的Marker分子ABCA8a（正好这个是脂代谢相关的marker）
结果显示， ABCA8a 的过表达促进了 BODIPY-C16 从 iPSC 的外流及其转运到 PDAC 细胞中，相反， Abca8a 的耗竭减少了BODIPY-C16外排及其向PDAC细胞的转运（图DE）。
先前的研究表明，富含脂质的细胞通过游离脂肪酸或细胞外囊泡将其脂质转移到周围细胞。所以作者想看是转移的什么类型的脂质。
首先，作者将 BODIPY-C16 标记的 iPSC 的 CM 根据大小分为三部分：
游离脂肪酸 （<10 kDa）
脂肪酸载体：中型 （10-100 kDa） 和大型 （>100 kDa） 级分。
在大尺寸（>100 kDa）和中型（10-100 kDa）脂肪酸组分处理的PDAC细胞中观察到荧光信号增加（图FG）
另一方面，iPSC中ABCA8a的过表达增加了BODIPY-C16向PDAC细胞的转运，特别是在中等大小的CM组分中，类似于ABC家族介导的高密度脂蛋白（HDL）颗粒的大小（图FG）
进一步的，作者研究 CAF 中 ABCA8a 转运蛋白对 体内 肿瘤生长的影响
iPSC 与 PDAC 细胞的共同接种显着促进了 Setd2 WT 和 Setd2 ko组的tumor。（图H）
Setd2 ko 组中
iPSCs中 Abca8a 的耗竭减少促肿瘤生长的作用
而iPSC 的 Abca8a 过表达加速了 Setd2 ko 肿瘤生长
验证了我们的假设， 将 Setd2 缺陷的 PDAC 细胞植入 Abca8a −/− 小鼠，肿瘤的生长速度比野生型小鼠慢（图I-K）。

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进一步的就开始讨论到表观
既往研究强调了 H3K36me3 在与其他组蛋白标记共存中的关键作用，例如基因内 H3K27me3 或组蛋白 H4 乙酰化。
在Setd2 ko 的原位肿瘤中 H3K27me3 和 H3K27Ac 水平显着增加，同时 H3K36me3 水平降低 （图A），在KSC小鼠的胰腺肿瘤中也观察到一样的结果（图B）。
Setd2 ko 肿瘤表现出乙酰辅酶A水平的特异性增加，乙酰辅酶A水平是线粒体代谢的关键代谢物（图C）。
用CPT1a抑制剂或ACLY抑制剂（ETC-1002）阻断FAO可能在很大程度上损害肿瘤中的乙酰辅酶A和H3K27Ac（图D），强烈表明FAO-OXPHOS代谢过程增强与H3K27Ac的表观遗传重写之间存在关联。

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进一步，作者对从Setd2 WT 和 Setd2 ko 原位肿瘤中分选的PDAC细胞中的 H3K27Ac 和 H3K27me3 进行了 CUT&Tag 分析
并将RNA-seq数据与H3K27Ac和H3K27me3峰相关基因集的取交集，在基因体上具有H3K27Ac增益的基因显示出显著的整体上调，而与H3K27me3的关联较少（图DE）
研究表明，以组蛋白乙酰化为标志的基因内增强子与基因外增强子和启动子动态结合。
重点关注基因体和启动子区域 H3K27Ac 增加的 339 个重叠基因，它们与 ECM 受体相互作用、谷胱甘肽代谢、黏着斑、TGF-β 信号传导、细胞迁移和 OXPHOS 相关（图F）。
值得注意的基因包括 Bmp2 、小窝内吞调节因子（ Cav2 、 Cavin2 和 Cavin3 ）、谷胱甘肽代谢基因（ Idh1 、 Gpx2 、 Gsto1 、 Gsto2 、 Mgst3 和 Nqo2 ）、FAO-OXPHOS 相关基因（ Acadl 和 Acsl5 ）和与干性相关的TF（ 图F-H）。

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因为之前是H3K27Ac和H3K36me3
这儿就想看DEG 上的 H3K27Ac 增益是否直接取决于 H3K36me3 信号的丢失。
只有大约 10% 的 DEG（339 个中的 33 个，例如 Bmp2 、 Idh1 和 Klf4 的基因体中具有 H3K36me3 沉积 ）
在 Setd2 WT PDAC细胞，表明SETD2介导的H3K36me3缺失全局独立改变H3K27Ac（图H）。
IGV显示 Setd2 缺失后启动子（绿色）和基因体（粉红色、前两个内含子和/或外显子区域）中的 H3K27Ac 峰增加
Setd2 ，与 AP-1 家族 TF、JunB 和 Fosl1 结合一致（图H）
我们进一步研究了 H3K27Ac 增益对 Setd2 ko PDAC的进展。在原位肿瘤中，JQ1 部分抑制 Setd2 ko 肿瘤细胞中肿瘤生长、富含脂质的 TME 和 OXPHOS 活性（图I-K）。JQ1 还抑制了 Setd2ko中异位 H3K27Ac 沉积上调的基因表达 （图L）。
综上所述，这些发现表明 Setd2 缺失诱导异位 H3K27Ac 沉积，导致转录组重编程，从而改变肿瘤进展的代谢适应。

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最后作者也扯了临床相关性
这儿研究了SETD2/H3K36me3 水平与 ABCA8+FAP+的 人PDAC（hPDAC）中的CAFs 。
与动物模型一致，H3K36me3与ABCA8+FAP+hPDAC中的CAF呈现负相关，通过流式细胞术验证（图A-C）。
同时，H3K36me3 低 hPDAC 组织中存在脂肪细胞样细胞和分化程度较低的肿瘤细胞（图D）
此外，IHC 染色显示 H3K36me3 和 FAP 水平呈负相关 （ χ 2 = 20.930， p < 0.001），而 H3K36me3 与 PDPN 水平呈正相关 （ χ 2 = 9.871， p = 0.002） （ 图E）
总的来说，与KC小鼠相比，KSC小鼠胰腺组织 存在ABCA8+ FAP的 + CAF ，而总 CAF （PDPN + 细胞）较低。

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当然，如 图 1 所示，具有 SETD2 突变或低 mRNA 水平的 PDAC 表现出更高的 OXPHOS 活性。
最后作者用了PDX模型，将 S-Gboxin 和 JQ1 施用到 H3K36me3 low （n = 2） 和 H3K36me3 high（n = 3）胰腺PDX中（图F）。H3K36me3水平较低的PDAC对S-Gboxin和JQ1表现出更高的敏感性（图F）。相反，H3K36me3水平较高的PDAC对S-Gboxin表现出适度的反应，对JQ1没有显着的反应。 验证了临床效果。