独特的环状结构让二代测序较短的读长限制了对其鉴定以及定量，目前仅仅依靠其反向剪切序列；另外，环状RNA的表达总是与来源基因（host gene）线性RNA的表达纠缠不清，让我们很难区分差异是来源于反向剪切还是只是来源基因的副产物。
对此，许多软件在识别上下功夫，比如DCC、CIRCexplorer、CIRI等等，然后用DESeq2或edgeR进行差异分析；而另一些软件在定量上使劲，对环状 RNA 的定量不仅仅使用反向剪切序列（BSJ），而且考虑到来源基因线性分子表达的影响，使用BS ratio进行定量，例如DCC、CIRI2、CIRIquant以及CLEAR。当然这种定量就不适合用于DESeq2或edgeR，一般可以用DCC::CircTest或CIRIquant等软件进行差异分析。
DEBKS介绍
最近北大基础医学院杨恩策团队提出了环状RNA差异分析的新方法DEBKS，对BS ratio进行了优化（公式及图解如下）。
对此，DEBKS设计了4个模块（见下面的流程图）
- merge，整合不同样品的环状RNA
- count，对来源基因的线性RNA进行定量
- anno，评估环状RNA长度
- dec，检测差异表达环状RNA
以及两个差异表达模式
- paired，配对的样品
- unpaired，非配对的样品
性能评估
作为一款工具，我们需要首先对其性能进行评估。
作者首先用了两套公共数据集检测了DEBKS识别差异环状RNA的检出率并用RT-qPCR进行了验证；随后，用模拟数据对DEBKS以及其他软件进行了评估，评估内容包括
- 重复样品表达一致性检验
- AUC，真阳性率以及假阳性率
- 差异表达基因检测敏感性
- 来源基因表达对差异环状RNA的影响
通过比较，DEBKS具有更优秀的性能并且更少受来源基因表达的影响。
局限性
由于需要包含线性剪切位点的表达（LJC），因此，DEBKS只能应用于既包含环状 RNA又包含线性RNA的测序，例如rRNA-depleted RNA-seq或exome capture RNA-seq。
另外，基因间区的环状RNA由于缺乏线性分子的表达，因此无法用DEBKS评估。
结束语
虽说目前差异分析几乎被edgeR/DESeq包揽，然而面对复杂多样的生物学情景以及日益增长的多组学信息，分析工具的多样性和特异性是非常有必要的。
环状RNA研究越发蓬勃，然而专门的工具却仍旧匮乏，另外，有些工具走着走着就丢了。虽然DEBKS在文章中提到表现比较优秀，然而能不能成为环状RNA研究的利刃，仍需要大量真实数据去检验。
参考资料：
