搜索基因的mRNA序列

选择gene，搜索框中输入基因名称、human/其他物种，然后search
注意选择人类的基因，点进去

选择mRNA

向下滑动到mRNA and protein
此处有NRxxxxx数字，为NCBI给出的标准mRNA序列，选择一个点进去

• tips，选择的时候可以去页面上方，看看实际图，对应的mRNA的在基因上的对应位置

再向下有NRxxxxx数字，这是非编码RNA的
再向下有NXxxxx数字，这是非NCBI认证的私人上传的mRNA序列

查询CDS序列

因为CDS序列比较保守稳定，引物最好设计在这个区域内，记住CDS对应的多少~多少，后边用

引物条件设定

点击页面右侧的primer picker
进入引物条件设定

qRT-PCR染色法——设定参数

• 填写入CDS序列范围

  
  
  image.png

• PCR product长度设定80-200

  
  
  image.png
• 返回的引物对数，改成20
• Max Tm difference改为2.5

• 选择必须跨外显子-外显子

  
  
  image.png

防止残留的基因被引物扩增，对qPCR造成污染

• 勾选在新页面打开
• 提交引物设计
• 若提示有匹配不同的转录本，可以选择100%的，或者不选，继续提交
• 得到数对引物
• 选择blast到别的位置比较少的引物对
• Self 3‘ complementarity选择都在4以下的

得到的引物在oligo中验证

ps:新手上路，有错误敬请指正~