蛋白质是生物体内最重要的功能分子之一，研究体内蛋白质的相互作用对于揭示生物学过程、发病机制以及药物作用的分子靶点具有重要意义。Co-IP(免疫共沉淀，Co-Immunoprecipitation)是一种用于研究蛋白质相互作用的技术，它能够特异性地富集目标蛋白及其互作的蛋白或蛋白复合体。Co-IP技术通常与质谱（MS）联用，形成CoIP-MS，以实现对蛋白质相互作用的高深度定性 和定量分析。
一实验原理
细胞内天然存在蛋白质复合物（A-B 或 A-C-B），Co-IP技术是利用抗体对抗原的特异性识别，将目标蛋白（诱饵蛋白，Bait）及其在生理条件下结合的相互作用蛋白（猎物蛋白，Prey）从复杂的细胞裂解液中共同沉淀下来，通过Western Blot（WB）或质谱（MS）鉴定，从而验证两种或多种蛋白质
之间是否存在相互作用。
抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白 A/G（Protein A/G）偶联的agarose 或 Sepharose 珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白 A/G-抗体-目的蛋白复合物，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白、互作蛋白和少量的杂蛋白。
核心
①特异性结合：抗体与目标蛋白（抗原）发生特异性结合
②固相捕获：抗体通过偶联的固相基质（如 Protein A/G 磁珠/琼脂糖珠）被固定和捕获
③共沉淀：与目标蛋白在天然状态下结合的其他蛋白，随目标蛋白一起被沉淀
④洗脱检测：通过 Western Blot 或质谱分析鉴定共沉淀的相互作用蛋白
二实验流程
① 载体构建：A 构建在 pcDNA3.1-C-6His 载体，B 构建在 pCMV-3Tag-1a-flag 载体；
② 细胞转染：细胞传代和转染；
③ 蛋白提取: 收集细胞并裂解，以获取目标蛋白；
② 蛋白表达鉴定：取 20 μL 总蛋白进行蛋白质电泳，分别用 HIS 抗体和 FLAG 抗体检测两个蛋白表达情况；
③ 免疫共沉淀：通过将特定抗体固定在磁珠上，使其与目标蛋白结合形成复合物；
④蛋白检测: 最常见的分析方法包括WB和质谱分析，用于进一步确认目标蛋白的免疫共沉淀结果。
三结果解读
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1、实验分组（竖列）
第 1 组（A-His+/B-Flag-）：仅转染 / 表达 A-His，为阴性对照组；
第 2 组（A-His+/B-Flag+）：共转染 / 共表达 A-His 和 B-Flag，为实验组。
2、Input
进行IP前制备总蛋白样本，作阳性对照组，验证实验体系中 A、B 蛋白的成功表达，排除【IP 无信号是因为蛋白未表达】的假阴性，同时为 IP 样本的上样量提供参照。
3、IP（Immunoprecipitation，免疫沉淀）
Co-IP 的核心步骤，原理是利用抗原 - 抗体的特异性结合。
例如图中“IP: α-His”的意思：用His 标签的特异性抗体（偶联磁珠），特异性结合 A-His 融合蛋白，将 A 蛋白从总蛋白中沉淀下来；若 B 蛋白与 A 蛋白存在相互作用，则会随 A 蛋白一起被沉淀下来。
4、WB（Western Blot，蛋白质免疫印迹）
部分文献写作 IB/Immunoblotting：用于检测 IP 产物 / Input 样本中目标蛋白的存在。
WB: α-His：用 His 标签抗体做 WB，验证 IP 步骤中 A 蛋白的成功富集（IP 效率），同时验证 Input 中 A 蛋白的表达；
WB: α-Flag：用 Flag 标签抗体做 WB，核心目的是验证 B 蛋白是否随 A 蛋白被共沉淀，是判断 A、B 蛋白相互作用的直接依据。
5、结果
对照组 Input 仅检测到 A，IP 仅检测到 A，验证 IP 成功且无假阳性；
实验组 Input 同时检测到 A、B，IP 中 A、B 均被检出，证明 A 与 B 存在特异性相互作用。
四文献案例
学习完基本的Co-IP结果图解读，小e还准备了3篇高分文献案例，通过实际应用场景，帮助各位老师更好理解科研中使用Co-IP实验技术的目的和结果。
案例一：AMPKα2 通过促进 NCOA4 蛋白降解，减轻三阴性乳腺癌中阿霉素诱导的铁死亡
文章：AMPKα2 attenuates doxorubicin induced ferroptosis by promoting NCOA4 degradation in triple negative breast cancer
期刊：Drug Resistance Updates
影响因子：21.7
摘要：
三阴性乳腺癌（TNBC）是一种侵袭性强、治疗选择有限且常出现化疗耐药性的乳腺癌类型。 AMPK 催化 α 亚基2（AMPKα2）与多种癌症的化疗耐药性发展密切相关，但 AMPKα2 在 TNBC 对多柔比星（DOX）耐药中的作用尚待阐明。本研究通过蛋白质印迹法检测DOX耐药 TNBC 细胞中 AMPKα2 的表达水平；采用脂质过氧化、细胞内铁含量、丙二醛（MDA）及 GSH 检测法评估 AMPKα2 对DOX诱导铁死亡的作用；运用蛋白质印迹、定量实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、共免疫沉淀（Co-IP）、免疫荧光染色及KFERQ -mCherry报告基因实验验证 AMPKα2 的功能及其与NCOA4降解的关联。证明：AMPKα2 通过在S151位点磷酸化NCOA4诱导其依赖CMA通路的降解，从而抑制DOX诱导的铁死亡；靶向 AMPKα2 可能成为克服 TNBC 患者DOX耐药性的潜在策略。
案例二：TNFAIP2 通过 KEAP1/NRF2 信号通路介导头颈部鳞状细胞癌产生顺铂耐药
文章：TNFAIP2 confers cisplatin resistance in head and neck squamous cell carcinoma via KEAP1/ NRF2 signaling
期刊：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research
影响因子：12.8
摘要：本研究旨在探究头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）顺铂耐药的机制，发现TNFAIP2的高表达与 HNSCC 患者不良预后、顺铂耐药及细胞内低活性氧（ROS）水平密切相关，其通过自身DLG 基序与KEAP1的 Kelch 结构域结合，竞争性抑制NRF2的泛素蛋白酶体降解，使 NRF2 累积并激活下游抗氧化基因，进而抑制 ROS 介导的 JNK 磷酸化及顺铂诱导的细胞凋亡，最终赋予 HNSCC 顺铂耐药性；体内外实验证实靶向敲低 TNFAIP2 可显著增强顺铂对 HNSCC 的治疗效果，且 HNSCC 标本中 TNFAIP2 与 NRF2 及其下游靶基因呈正相关，提示TNFAIP2可作为改善 HNSCC 顺铂治疗效果的潜在靶点。
【Co-IP实验】共同验证TNFAIP2 通过与 NRF2竞争性结合 KEAP1，破坏 KEAP1-NRF2 复合物的形成。在 FADU 和 CAL33 两种 HNSCC 细胞系中平行验证。MG132 蛋白酶体抑制剂，阻断泛素化蛋白降解，便于检测泛素化水平。si-TNFAIP2，si- 是小干扰 RNA，siRNA 的缩写，本质是一种用来 “敲低”目标基因表达。
案例三：小鼠心脏发育过程中定位于线粒体的 NOTCH1 可促进线粒体代谢与内皮 - 间充质转化
文章：NOTCH1 mitochondria localization during heart development promotes mitochondrial metabolism and the endothelial-tomesenchymal transition in mice
期刊：nature communications
影响因子：15.7
摘要：Notch 信号通路的激活可驱动内皮间质转化(Endothelial-to-Mesenchymal Transition, EndMT)，这一过程对心脏发育至关重要。本研究旨在探讨 EndMT 过程中 Notch 信号通路与代谢重编程之间的相互作用。从生物化学层面，发现 NOTCH1 胞内域(NOTCH1 intracellular domain, NICD1)定位于内皮细胞的线粒体中，在此与丙酮酸脱氢酶（PDH）复合物相互作用并激活该复合物，进而增强线粒体代谢。与野生型 NICD1 相比，将 NICD1 靶向定位于线粒体可诱导更显著的 EndMT；在先天性心脏病小鼠模型中，孕期使用小分子激活 PDH 可改善疾病表型。在非综合征型法洛四联症（tetralogy of Fallot, TOF）患者中发现的一种 NOTCH1 突变，会降低心肌组织中 NICD1 的线粒体定位水平，进而下调 PDH 活性。综上，本研究表明，NICD1 在发育中的小鼠心脏线粒体中富集，通过激活 PDH、改善线粒体代谢来诱导 EndMT。
【Co-IP实验】从外源性过表达（图A）和内源性生理状态（图B）两个层面，验证NICD1 与 PDHB 之间的特异性相互作用。
五Co-IP实验常见问题解决方案
1、Western Blot无目的条带
可能原因：裂解液中诱饵蛋白未释放或发生降解。
解决方案：检查裂解液成分，添加新鲜蛋白酶抑制剂；采用超声辅助裂解。
2、背景条带多
可能原因：非特异性结合。
解决方案：增加洗涤次数或提高洗涤液盐浓度；延长预清除时间。
3、靶蛋白条带正常，互作蛋白无信号
可能原因：蛋白间相互作用较弱或为瞬时结合；裂解液条件破坏了互作复合物。
解决方案：改用更温和的裂解液；添加化学交联剂（如DSS）稳定互作；延长抗体孵育时间。
