这篇文章于2023年5月发表于Cell Metabolism（IF=29，Extracellular vesicles in fatty liver promote a metastatic tumor microenvironment），探讨了胞外囊泡对肿瘤微环境形成的作用及其机制，正在进行相关研究或者苦于细胞间相互作用机制探索的同学可以借鉴一下：
研究意义：结直肠癌（CRC）发病率位居所有癌症的第三位，死亡率位居第二。肝脏是CRC转移最常见的器官，其独特的代谢和免疫微环境有利于CRC的肝脏转移。70%的CRC患者会发生肝转移，这是CRC致死的主要原因。肥胖和非酒精性脂肪肝（NAFLD）是CRC的重要危险因素，脂肪肝会促进CRC肝脏转移以及CRC肝转移癌组织切除术后复发。CRC肝转移小鼠内，脂肪肝通过改变肝脏炎症和免疫微环境促进转移癌细胞生长。因此，发生癌转移脂肪肝其肿瘤微环境（TME）的异质性可能会导致不同CRC迁移机制，这可能解释不同CRC患者对治疗方式应答的差别。这也提示：对患有脂肪肝的CRC患者，其肝转移的治疗需要采取不同策略。所以，阐明患有脂肪肝CRC患者其肝转移的分子机制有重要的临床意义。
胞外囊泡（EVs）含有microRNAs、脂类和蛋白质等具有生物活性的物质，神经酰胺合成通路是调控其生成和分泌的主要通路（主要由中性鞘磷脂酶和Rab27a/RAB27b等蛋白调控）。Rab27a可以介导黑色素瘤EVs的产生和转移，对脂过载引起的EVs分泌至关重要。NAFLD患者肝细胞来源的EVs分泌增加，其含有的microRNAs发生显著改变。此外，有研究指出，肿瘤来源的EVs可迁移至肝脏并促进利于肿瘤细胞迁移和促迁移炎症应答环境的形成，但CRC肝转移是否与EVs有关未知。
YAP是转录辅因子，在未被MST1/2-LATS1/2通路磷酸化时，YAP入核和促癌转录因子结合，促进癌细胞增殖、侵袭和迁移相关基因表达。此外，G蛋白偶联受体和microRNAs也调控YAP的活性。YAP还通过上调PD-L1表达或募集M2型肿瘤相关巨噬细胞（M2-TAMs）及髓系来源抑制细胞构建免疫抑制微环境，最终促进肿瘤进展。但YAP在EVs介导的CRC肝转移的作用及其调控机制还未有相关报道。
研究策略：研究人员通过CRC和其肝转移的密切关系确定的研究目的，然后引入EVs介导的细胞-细胞间的相互作用来探讨肝脏微环境对CRC肝转移肿瘤细胞的影响作用和机制。接下来作者特异性的检测了EVs的重要内容物microRNAs在不同条件下的变化谱并锁定了发挥作用的关键microRNAs，并依次进行下游靶点的筛选和功能验证，最终在患有脂肪肝的CRC患者的肝转移组织中验证出：肝细胞分泌EVs→EVs内容物microRNAs抑制Lats2表达→YAP活性增加并入核→直接促进CRC肿瘤细胞生长/通过CYR61构建肿瘤抑制微环境→促肿瘤进展这一促肿瘤进展的信号轴。
研究方法：
1、Increased extracellular vesicle release by fatty liver enhances metastatic tumor growth in the liver（确认CRC肝转移肿瘤细胞生长和EVs及脂肪肝的关系）
首先需要确认脂肪肝对CRC的肝转移和转移后生长有影响。作者给予小鼠高/低脂饮食（HFD/LFD）构建脂肪肝小鼠模型，再于脾脏处注射MC38（CRC细胞系）构建CRC肝转移模型。高脂饮食小鼠肝脏肿瘤显著增大，且小鼠和患者血清EVs数量显著增加（图1A-B）。此外，给予HFD小鼠来源以及患者来源的EVs能显著促进CRC癌细胞增殖、迁移和侵袭（图1C-E）。用棕榈酸酯（PA，NAFLD患者最丰富的脂类）处理小鼠原代肝细胞（PHCs）和Huh7肝癌细胞系，收集上清里的EVs处理细胞。PA促进PHCs和Huh7细胞EVs的分泌，而上述来源EVs促进癌细胞增殖、迁移和侵袭（图1F-G）。综上，NAFLD患者肝细胞分泌的EVs促进CRC肝转移肿瘤生长。
Rab27a/b和中性鞘磷脂酶是调控EVs合成分泌的主要蛋白。HFD饮食小鼠肝脏和NAFLD患者肝脏Rab27a表达显著增加（图2A-B）。敲低Rab27a抑制HFD小鼠CRC肝转移肿瘤生长，但对LFD小鼠没有影响（图2C-D）。相反，过表达Rab27a促进CRC肝转移和生长。综上，肝细胞Rab27a高表达促进患脂肪肝的CRC患者的肝转移和生长，这与Rab27a介导的EVs生成有关。
2、miRNAs are the functional extracellular vesicle contents that aggravate colorectal cancer growth in fatty liver（确认患脂肪肝的CRC患者肝细胞分泌EVs促进肝转移CRC进展的内容物）
接下来作者探讨了EVs内容物对肝转移CRC细胞的作用。对健康/NAFLD患者、LFD/HFD饮食小鼠、LFD/HFD饮食CRC模型小鼠来源血的EVs以及HFD饮食小鼠肝细胞和PA处理小鼠肝细胞培养上清EVs的microRNAs进行了分析。miR-103、miR-25和miR-92a显著上调（图3A）。接下来便是对microRNAs影响CRC细胞的功能验证。PA处理肝细胞EVs里miR-103、miR-25和miR-92a表达增加，癌细胞内过表达microRNAs促进细胞增殖、迁移和侵袭，抑制micrRNAs则缓解癌细胞增殖、迁移和侵袭（图3B-F）。综上，miR-103、miR-25和miR-92a是患有脂肪肝的CRC患者肝细胞分泌的EVs促进肝转移结直肠癌生长的重要调控因子。
3、EVs containing miRNAs regulate pro-tumorigenic YAP signaling in colorectal cancer cells（寻找内容物下游）
接下来作者尝试找到上述microRNAs调控的直接靶点。通过同时使用多种生物信息学预测工具，作者发现Lats2（YAP经典上游）表达显著下调（图4A-B）。过表达microRNAs促进YAP入核（图4C）。荧光素酶报告基因实验表明，microRNAs通过与Lats2的3’UTR区结合抑制其转录（图4D）。PA处理肝细胞来源的EVs降低Lats2表达并促进YAP核定位，抑制microRNAs则逆转上述改变（图4E-F）。综上，miR-103、miR-25和miR-92a通过直接抑制Lats2表达激活YAP，促进CRC进展。
4、YAP activity is increased in colorectal cancer liver metastasis enhanced by non-alcoholic fatty liver disease
RNA-seq结果表明，HFD饮食小鼠肿瘤细胞YAP和癌症进展相关基因显著富集（图5A）。HFD饮食CRC小鼠其转移肿瘤细胞YAP核定位、YAP表达和下游靶基因表达显著增加，但上游抑制分子Lats2表达显著下调（图5B-D）。敲低HFD饮食CRC小鼠肝细胞Rab27a恢复肝转移肿瘤Lats2表达、YAP的核定位以及靶基因表达（图5E）。因此，患有脂肪肝的CRC患者肝细胞分泌的EVs通过上调YAP活性促进肝转移肿瘤进展。
5、YAP signaling promotes metastatic tumor growth and an immunosuppressive environment in fatty liver
接下来作者进一步探讨了YAP在脂肪肝肝细胞EVs促肝转移CRC进展的作用机制。敲低肿瘤细胞Yap1抑制PA处理肝细胞分泌EVs对CRC细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用（图6A）。体内实验结果表明，敲低癌细胞Yap1显著抑制肿瘤生长和相关促肿瘤进展信号通路（图6B-C）。脂肪肝可通过促进M2-TAM浸润形成免疫抑制微环境，而敲低肿瘤细胞Yap1则抑制脂肪肝引起的M2-TAM浸润（图6D）。肝脏巨噬细胞和肿瘤细胞共培养显著促进巨噬细胞迁移，而敲低肿瘤细胞Yap1则抑制肝脏肿瘤细胞迁移（图6E）。此外，上述共培养促进巨噬细胞向M2极化，而敲低Yap1抑制极化作用（图6F）。因此，YAP既促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，又间接调控癌细胞TME。
接下来作者想找到YAP调控肿瘤细胞TME的下游分子。在众多YAP下游分子里，Ccn1编码的CYR61是分泌型的趋化因子，其在CRC的表达随YAP敲低而降低（图7A）。体内和体外实验结果表明，敲低肿瘤细胞的Ccn1能抑制共培养巨噬细胞的迁移和M2极化（图7B-C）。因此，YAP通过调节CYR61的表达和分泌介导TME。此外，作者还利用单细胞RNA-seq对肿瘤细胞周围的免疫细胞进行了分析。他们在高脂饮食小鼠肿瘤组织找到了2个M1 TAM亚群 、4个M2 TAM亚群和2个CD8+T细胞亚群，且M2亚群均属于NAFLD疾病里支持肿瘤生长的巨噬细胞亚型（图7D-E）。
6、Increased YAP activity and an immunosuppressive tumor microenvironment in patients with colorectal cancer liver metastasis and non-alcoholic fatty liver disease
最后，作者用患有脂肪肝的CRC病人样本对上述结果进行了确认。患有脂肪肝的CRC病人其肿瘤组织YAP核定位、CYR61表达和肿瘤组织M2-TAM的浸润显著增加（图8A-B）。质谱流式技术（Imaging mass cytometry，IMC）结果显示，患有脂肪肝的CRC患者M2-TAM和CD8+T细胞显著增加（图8C-D）。患有脂肪肝的CRC病人原发病灶肿瘤组织YAP和Ki67表达较没有脂肪肝的CRC病人原发病灶高，而转移肿瘤组织YAP和Ki67表达比原发病灶高（图8E）。对细胞间距离进行分析发现，M2-TAM更接近YAP阳性的肿瘤细胞，而CD8+T细胞则相反（图8F）。患者样本检测结果表明，脂肪肝影响CRC肝脏转移肿瘤组织的YAP表达、肿瘤细胞生长以及其周围免疫细胞的功能和分布。
Take-home message：
这个故事结合临床“CRC患者普遍会发生肝转移”，以及脂肪肝会促进CRC肝转移肿瘤进展和复发的临床现象，提出“脂肪肝影响CRC肝转移肿瘤进展机制”。这里他们利用EVs这一可以在细胞间递送具有生物活性分子继而介导彼此间作用的特殊结构进行预实验。他们发现EVs的确介导了脂肪肝肝细胞对CRC肝转移肿瘤的促进作用。此外，在探讨可能作用机制的时候，直接锚定在了microRNAs，后续也的确找到了有效应的三条microRNAs。然后他们以microRNAs为突破口，接下来就是一系列下游靶点预测和相应功能的验证。总体而言，这个故事临床意义较大，为CRC的肝脏转移和复发提供了新的治疗方向和靶点，机制层面EVs到YAP调控肿瘤细胞的免疫微环境的验证也较完整。但具体患有脂肪肝的CRC患者其EVs分泌为什么增加（Rab27a表达调控上游），以及肿瘤细胞CYR61介导免疫抑制微环境形成的具体分子机制是没有阐明的问题。YAP促进肿瘤细胞增殖、迁移和分化已有很多相关报道，可能这是作者后面提出YAP可以调控局部微环境的原因（增加新颖性）。此外，YAP的上游LATS2表达固然重要，但考虑到其活性受磷酸化调控，仅仅检测其表达说服力不足。
做一个好课题，运气是非常重要的。就这篇文章而言，没有前期的研究做铺垫，突然提出“EVs影响肝转移肿瘤进展”以及“EVs内的microRNAs是影响EVs作用的主要分子”这种假说，恰好表明科研有时候是没有逻辑的。科研有时候就和投资一样：风险越大，收益越大。如果做科研的路上没有思路和想法，不妨跳出固有的思维逻辑，冒险尝试一些不同的想法，可能会别有一番天地。
