此前我们也整理过类似的话题：
读研/读博是一个漫长的过程，就像在一个黑屋子里洗衣服，不开灯的时候永远不知道衣服洗干净没。也就是说在毕业前，大家很难衡量自己的工作是否能作为一个合格甚至优秀的毕业课题来结题。这种情况下，参考已公开的毕业论文就是自我评价与参考的最佳途径，这里选取了四篇具有代表性的硕士论文进行了解析，希望能够帮助到大家。
由于空转仍处于一个高、新、贵技术的地位，能够参与此类技术相关研究的硕士往往受到的经费、学术资源支持充足、个人能力等方面比较超群，论文完成质量与水平也非常高(有被卷到)。总体看来，四篇论文都涉及到单细胞与空转的联合分析，也都涉及到免疫微环境的解析(打单细胞时代开始就有的优势)。涉及到分子原位杂交、免疫荧光等空转"专属"的验证实验，此外也涉及到流式细胞术、ELISA、荧光素酶实验、RIP 测序、transwell迁移等等实验(全员干湿结合，卷飞了)。所以还是建议大家早点上车，每年都在水涨船高。
我们也有过比较系统的空转分析教程，供大家参考：
第一篇
“单细胞测序与空间转录组联合分析狼疮肾炎的免疫学机制”作者于2023年毕业于中南大学，培养于湘雅三医院，从事免疫相关疾病的研究。本毕业论文全文58页，主要的研究内容分为两章展开，分别是狼疮肾炎肾脏免疫图谱的建立和APOE+单核巨噬细胞在该疾病肾脏中的关键作用。本研究综合运用了单细胞转录组测序、空间转录组测序，结合免疫荧光、流式细胞术和酶联免疫吸附法等多种技术方法进行了相关研究，是一篇质量较高的毕业论文。
在本研究中，首先作者利用单细胞转录组测序分析了肾脏组织中的肾实质细胞和免疫细胞，确定了狼疮肾炎患者肾脏的特异性免疫细胞。其次，作者通过空间转录组测序对狼疮肾炎患者肾脏特异性细胞的空间分布进行了研究。最后，通过免疫荧光染色验证了狼疮肾炎患者肾脏中特定的免疫细胞类型，通过特异性流式细胞术和酶联免疫吸附法进行了功能实验。
肾脏样本的选取
研究思路
我们可以看到，本研究采用的是肾活检程序获得的临床样本，结合了多种分析方法和实验手段进行研究，值得一探。下面带大家看一下具体的实验结果：
单细胞测序的分群
- 通过质控程序，作者筛选出了基因计数在 0 至 5,500 之间及 UMI 计数低 于 70,000 的细胞，并排除了线粒体基因超过 95%的细胞，共保留了 31,738 个细 胞用于进一步的分析。
- 降维聚类分群后，作者最终将肾脏细胞注释为10种主要的细胞类型，并用气泡图展示了各细胞类型的代表性基因表达。
- 作者对狼疮肾炎患者肾脏和对照组肾脏的各细胞类型比例进行了可视化。作者点出了CD45+细胞在狼疮肾炎患者中明显升高。
LN 肾组织中的空间转录组细胞定位
空间转录组学测序的结果主要展示在直径为 55μm的圆形区域内。此区域直径大于单个细胞直径（10-20μm）。作者最终将所有细胞类型注释为了6种细胞亚群，其中免疫细胞的数量超过了1/5。
作者通过将这6群细胞表示在空间转录组学的切片上，指出免疫细胞分布在肾小球内外及周围。作者表明，肾小球的免疫浸润可能与狼疮肾炎有关。
免疫细胞亚群分析
- 基于单细胞测序分析的细胞注释结果，作者将对 CD45+免疫细胞进行了 UMAP 的降维分群，通过免疫细胞标志物和细胞分类增殖标志物将其分成了6个亚群。作者指出，与正常组织相比，髓系细胞数量显著增加。
接下来这部分的结果表明，髓系细胞可能在狼疮肾炎患者肾脏的IFN反应中发挥重要作用：
对免疫细胞的KEGG富集分析结果表明髓系细胞的抗原提呈功能在狼疮肾炎的发病中起着重要作用，NK细胞和T细胞的代谢状态可能也发生了改变。
GSVA富集结果显示，IFN-α 和 IFN-γ 的反应性在髓系细胞中最为丰富，表明髓系细胞通过分泌IFN和参与IFN反应调节 狼疮肾炎的自身免疫反应。
作者通过AddModuleScore函数计算了IFN分数，发现髓系细胞的 IFN 富集分数相对较高。
对髓系细胞中占比较多的 CD14+单核细胞进行免疫荧光染色的结果显示：CD14+单核细胞与IFN-α 在 狼疮肾炎患者肾内存在明显高表达。
LN 中的 B细胞图谱
- 作者将免疫细胞中的所有B细胞进一步分为了B0和B1两个细胞群，发现这两种细胞群中的部分基因表达存在明显差异。B1细胞群的GO功能富集结果显示，B细胞对髓系细胞的分化可能有一定影响。GSEA 通路富集分析表明B细胞激活通路主要为脂质相关通路、MAPK 信号通路等。
LN 中的T细胞图谱
- 使用与上述B细胞分析相同的分析思路和方法，作者对T细胞也进行了相关分析，最终将T细胞分为3群。研究结果表明，不同亚群的T细胞功能有明显差异。对T细胞整体进行的GSEA 分析结果显示，与狼疮肾炎相关的通路处于高度激活状态。
LN 特异性树突状细胞亚群
- 作者接下来将髓系细胞进一步分为2个经典的细胞亚群： DC 和 Mono/MΦ。Mono/MΦ 在 狼疮肾炎患者的髓系细胞中占据了近 80％，正常肾脏中则几乎不存在DC细胞。作者又进一步将DC细胞注释为了 CD1C+CLEC10A+和 FLT3+CLEC9A+两类。
- 作者这部分的内容中的大篇幅是基于对单细胞测序结果进行分析的，首先通过细胞分群定位到狼疮患者肾脏中 CD45+免疫细胞浸润明显增加，接下来对免疫细胞进行了进一步的分群注释和富集分析，主要包括髓系细胞、T细胞和B细胞。结果表明，狼疮肾炎中干扰素反应的上调和自身性抗原提呈异常升高与髓系细胞密切相关。
- 基于空间转录组测序，分析占比较少，作者证实了免疫细胞的空间分布集中在肾小球内外及周围。
LN 特异性单核巨噬细胞亚群
- 接下来作者进一步对免疫细胞分型，基于基因差异表达将 LN 肾内单核细胞降维成 9 个 Mono/MΦ 亚群（图 3-1a），且正常与 LN 肾组织中的亚群差异显著。在 LN 患者中，APOE+ Mono、SPP1+ Mono、IL-1B+ Mono 比例显著上升（图 3-1c）；APOE+ Mono 高表达 SELENOP（图 3-1d），RNASE1 表达也与特定小鼠损伤后现象有关。研究还预测了 Mono/MΦ 间的细胞相关性（图 3-1e），APOE+ Mono 与 LYZ+ Mono 相关性低，与 SPP1+ Mono 相关性高，后续拟时序分析也佐证了这一点，显示其分化的特征。
单核巨噬细胞亚群的投射
作者接下来通过 prediction assay 算法将 scRNA-seq 结果投射到 ST 结果（类似教程：一文搞定空间转录组与单细胞测序的整合分析），分析 55μm 圆形区域细胞成分。TIMP+ Mono 和 ITLN+ Mono 未投射成功，提示其聚集和数量状况不佳。APOE+ Mono 等主要分布于肾小球周围及肾间质（图 3-2a-b），EC_Mono mixture 等在肾小球内分布，暗示肾小球内细胞相互作用与 LN 进程有关。
免疫荧光染色验证结果显示，LN 患者肾脏中 APOE 与 CD14 共表达（正常无），IL1B 或 SPP1 与 CD14 共表达高于正常组织，LYZ 和 CD14 共表达无差异（图 3-2c），与前期结果一致。
**髓系细胞的细胞间通讯 **
接下来作者运用 NicheNet 算法分析髓系细胞通讯()，按配体活性选免疫细胞前 20 个活性配体，其在 LN 患者中的表达高于正常对照组（图 3-3a）。
NicheNet 分析出 IFNG、APOE、TNF 等为高优先级配体。IFNG 的预测目标基因含髓系细胞标志物，表明髓系细胞是 IFN-γ 主要效应细胞；APOE 目标基因是 CCL3 和 CXCL12，可能调节免疫细胞趋化（图 3-3b - c）。基因相关性分析显示 APOE 与干扰素刺激基因正相关（图 3-3d），进一步证实 APOE 在 LN 中的重要性。
APOE+单核巨噬细胞在LN中代偿性增高并且具有抗炎作用
作者接下来用 Monocle 3 (教程：《拟时序分析》6.monocle3的拟时序分析)对狼疮肾组织 Mono/MΦ 进行拟时序分析，结果与Seurat一致，MRC1+ Mono 为起点，正常时分化为 LYZ+ Mono，LN 环境下变为 APOE+ Mono，分化中 TIMP1、IL1B、SPP1 高表达。
在 HSV 刺激的 RAW264.7 细胞中，敲低 APOE 致 CD86 等表达改变，ELISA结果 显示 APOE 影响 IFN-α、IFN-γ 分泌。
作者用这部分内容表明，APOE 在LN中起到了抗炎作用，APOE+ Mono 是 LN 下单核细胞分化终点，其抗原呈递下降或为机体在自身免疫性攻击环境中的自救。
淋巴管的生成有助于单核/巨噬细胞向肾小球转运
作者确定 LN 特异性 Mono/MΦ 亚群及定位后，继续深入研究了其进入肾病灶的方式。因免疫细胞常经淋巴管入肾，故绘制相关标志物分布，发现 PDPN 沿肾小球线型分布，PROX1 和 VEGFC 围绕其周围，且 CD14 与淋巴管标志物相关（图 3-5a - b），推测 CD14 + 细胞借新生淋巴管到肾小球附近。
免疫荧光证实 PDPN 和 VEGFC 共分布（图 3-5c），且 LN 患者中 CD14 和 PDPN 呈线型，表明 CD14 + 细胞可能在淋巴管旁浸润（图 3-5d）。
- 作者通过结合单细胞转录组测序和空间转录组测序，发现 APOE+ Mono是LN中特殊的Mono/MΦ亚群，而APOE的上调能够显著降低单核细胞的抗原呈递和分泌IFN的能力。此外，LN中的淋巴管生成可能促进了Mono/MΦ在LN肾脏中的转运。
