很多WB人都遇到过这种情况👇
跑完胶、转完膜：
✅ Total Protein 有条带
✅ 内参正常
但是：❌ p-AKT、p-ERK等磷酸化蛋白信号很弱，甚至直接消失。
到底哪里出了问题？
这就为大家揭秘答案
① 裂解时没有加入磷酸酶抑制剂
细胞裂解后，里面的磷酸酶仍然可能发挥作用。
它会去除蛋白上的磷酸基团：
磷酸化蛋白 → 非磷酸化蛋白
所以最后检测时：
总蛋白还在，
但磷酸化信号已经降低。
② 样品处理时间过长，也可能导致磷酸化信号下降
磷酸化蛋白不像普通蛋白，
裂解后如果保护不足，
容易受到蛋白酶、磷酸酶影响。
所以裂解体系很重要。
传统RIPA需要：
❌ 自己添加蛋白酶抑制剂
❌ 自己搭配磷酸酶抑制剂
❌ 容易出现漏加、比例不准确的问题
对于磷酸化WB，
可以选择已经预混抑制体系的裂解液。
例如：
艾克生命 X-RIPA UltraMix预混裂解液
采用三合一预混配方，
预添加蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂等十几种抑制剂，
减少人为配制误差，帮助保护蛋白完整性。
③ 磷酸化WB封闭条件要注意
普通WB常用脱脂奶粉封闭。
但磷酸化蛋白检测时，更推荐：
✅ 封闭液
因为奶粉中的酪蛋白含有磷酸化位点，可能增加背景干扰。
