Proteomics integrated withmetabolomics: analysis of the internal causes of nutrient changes in alfalfa atdifferent growth stages
多组学方法解析双酚A对斑马鱼授精后胚胎代谢的影响
Environmental Pollution，2017，IF=4.35
研究材料：斑马鱼胚胎
技术平台：LC-MS/MS
方案设计：
选择不同浓度BPA溶液（对照，4.4mMBPA，8.8 mMBPA, 17.5 mMBPA）对受精后2h斑马鱼胚胎进行暴露处理 ；
暴露处理斑马鱼胚胎120h后，取样进行代谢组检测和分析，代谢组样品为4组样本，每组样本6个生物学重复，每个生物学重复10个胚胎；
暴露处理斑马鱼胚胎120h后，选择对照组和17.5mMBPA处理组斑马鱼胚胎进行转录组测序，每组3个生物学重复，每个重复8个胚胎；
对差异代谢物及差异基因KEGG分析，相关性分析，解析暴露于BPA环境中，斑马鱼胚胎代谢机制的变化；
研究背景:
双酚A（BPA）是一种常用的工业化学品，广泛用于制造聚碳酸酯塑料和环氧树脂，BPA衍生塑料通常用于生产各种商品，包括容器，电子产品和医疗器械。随着时间的推移，BPA通过将其与塑料单体连接的酯键水解而从原始塑料中泄漏。因此，大量的BPA不断释放到环境中，特别是地表水和地下水，最终进入废水处理厂并最终沉积在沉积物中。然而，如果其在环境中浓度过高会激活雌激素活性，对人类健康，野生生物和环境具有重要威胁。除了假定的内分泌和生殖毒性，一些作者认为BPA暴露会破坏激素平衡，改变性腺功能，并影响鱼的肝脏卵黄蛋白原产生。然而，其中一些影响的作用方式尚不完全清楚。
结果：
1.BPA处理后的斑马鱼代谢检测
对24个胚胎提取物进行PCA分析(图1)，发现不同浓度BPA处理的胚胎可以明显分开。对检测到的代谢物进行差异筛选，正负离子模式下分别筛选到30，29种差异代谢物，其中共有代谢物为9种。对差异代谢物进行聚类分析，代谢物的分级聚类揭示了两个主要的簇，一个包括在BPA处理时浓度增加的代谢物，第二个包括通过处理耗尽的代谢物（图2）。聚类热图也反映出，当BPA浓度较低时，胚胎显示出与未处理一致，BPA处理的两个高浓度的变化一致。功能分析显示，受BPA影响的大多数代谢物与氨基酸或核苷酸/核苷代谢途径有关。通过BPA处理观察到的核苷酸相关代谢物的减少，特别是次黄嘌呤和尿酸，可以解释为信号传导途径的变化。嘌呤代谢主要在BPA处理时下调，可能与观察到的谷氨酸水平增加有关。除此之外，脂质，糖及其衍生物以及类固醇代谢相关的生化途径的变化，与先前的转录组学和代谢组学一致。并且甘油磷脂代谢的变化提示BPA对细胞膜的损伤。
图1 .24个胚胎样本代谢物检测PCA分析
图2. 对照组和处理组差异代谢物聚类热图分析
2.BPA处理后的斑马鱼转录组分析
通过对对照组和17.5 mM BPA组mRNA水平变化的统计评估，发现差异表达基因1381个(FDR<0.05)，其中上调基因765个，下调基因616个。根据BPA处理时的表达变化（图3a，b），差异表达的mRNA水平的分级聚类确定了两个主要簇。 簇A包含通过BPA暴露上调的表达基因，而簇B包括下调基因。这些前二十个基因与不同生物过程的反应有关，包括雌激素刺激和异生素，氧化还原过程，代谢过程， 鳍再生，组织发育和细胞增殖。与之前的报道具有一致性，脑芳香化酶(cyp19a1b)是众所周知的鱼胚胎雌激素暴露的标记物，其在BPA处理样本中表达的增加与脊椎动物中BPA的雌激素活性一致。双酚a对参与细胞增殖和组织发育的不同细胞功能的破坏，核苷酸和氨基酸合成途径的改变可能与这些效应部分相关。此外，gstp2 mRNA水平的上调可能与GST活性的增加有关，这是对氧化应激和细胞凋亡增加的反应。GST活性的变化被认为是BPA污染水生生态系统的一个标志。
图3 对照组和胁迫组差异基因聚类热图
3.代谢组学和转录通路联合分析来解析通路的变化代谢组与转录组数据的整合提高了对缠在生物过程的理解，从而深入了解系统作用机制。本研究通过KEGG数据库定义的代谢通路，利用已有的生物学知识差异基因和代谢物的数据集进行评估。KEGG对差异代谢物和差异基因进行共同注释，注释到了70个通路，至少含有两个差异代谢物，38个通路至少含有4个代谢物。并且这38个通路至少含有2个差异基因，这个结果显示代谢组和转录组数据可以同时反映BPA胁迫对斑马鱼胚胎的影响（图5）。
4.代谢扰乱的生物相关性分析
筛选dre01100模块特有的45个差异代谢物和119个差异基因进行相关性网络图构建（图4）。其中与氨基酸代谢相关的基因和代谢物聚为第一大簇（图4，红色椭圆），与嘌呤代谢相关的生物标志物次之，但密度最大（图4，棕色椭圆）。因此，大部分代谢变化与蛋白和氨基酸的合成相关，是细胞的主要成分，与BPA胁迫导致的增值或者毒性相关。反映了BPA对鱼胚胎的信号/调节功能的破坏，这种活动与其作为内分泌干扰物的潜力有关。
通过基因和代谢物的上下调变化，可以推断观察到的不同生物标志物水平变化的生理意义（图4）。与嘌呤，视黄醇，叶酸和脂质代谢相关的大多数代谢物在BPA处理时浓度降低，而几种氨基酸浓度增加，这些变化与相同通路基因的变化也相关。氨基酰基trna合成的干扰与bpa处理的胚胎中氨基酸浓度的增加有关，可能与维持稳态所需能量的减少有关。氨基酸浓度的变化影响着下游几种依赖的代谢和生物合成途径。叶酸缺乏症对胚胎发育的潜在影响途径可能与BPA对机体的阻断作用有关，可能与抑郁症状有关。
图4. 差异代谢物和差异基因相关性网络图
类似地，BPA处理的胚胎样品中前列腺素（PGG2或6-酮-PGE1）浓度的降低可以通过观察到它们的产生酶ptgs2b的mRNA丰度的减少来解释。该效应与多达7种酶的表达增加相结合，所述酶催化来自共同前体，花生四烯酸或中间代谢物PGH2的替代途径（图5）
图5. (A)视黄醇和(B)花生四烯酸差异基因KEGG代谢通路图
结论：
代谢组和转录组分析，反映了将斑马鱼暴露于BPA中会导致明显的代谢变化。在通路水平上整合转录组学和代谢组学的结果，展示了BPA暴露后的受影响的代谢通路。这个结论显示，BPA和BPA-相关 化合物具有较强毒性作用，影响雌激素，雄激素，甲状腺癌，类视黄醇和前列腺素信号传导途径和胆固醇和脂质体内稳态。
