01一、文章信息
发表杂志名称：iMeta
中文标题：单细胞测序揭示 IL-33 + 内皮细胞亚群在促进早期胃癌进展中的作用
英文标题：Single‐cell sequencing reveals the role of IL‐33+ endothelial subsets in promoting early gastric cancer progression
影响因子：33.2
发表日期：2025 年 8 月
01二、研究概述
该思路适合结合热点来做，例如小编发现的新热点
小编发现一个新热点。以肿瘤为例，目前肿瘤中有180多篇研究，66篇10+文章，高分率惊人！nature，cancer cell等均报道与免疫逃逸相关。而生信文章几乎没有！
早期胃癌（EGC）是阻止胃炎向进展期胃癌（AGC）发展的关键阶段。为明确 EGC 的单细胞特征、肿瘤微环境（TME）细胞组成及潜在预测标志物和治疗靶点，作者利用临床活检和手术样本，构建了包含 184,426 个高质量胃癌细胞的单细胞 RNA 测序图谱。研究识别出 8 种不同细胞谱系状态，发现随疾病进展，上皮细胞元集群数量减少，而 T&NK 细胞、B 细胞、浆细胞、成纤维细胞、髓系细胞和内皮细胞数量增加。其中，某些上皮细胞亚群（化生干细胞样细胞（MSCs）、胃小凹黏液样细胞（PMC-like）、增殖细胞）、T 细胞亚群（调节性 T 细胞（Treg）、CCR7 阳性初始 T 细胞、CH25H+CD4+T 细胞、效应记忆 CD8+T 细胞（TEM CD8+）、GFPT2+CD8+T 细胞）及内皮细胞亚群（IL-33 + 静脉内皮细胞 - 1（IL-33+Venous-1）、ADAMTSL2 + 动脉内皮细胞 - 2（ADAMTSL2+Artery-2））在 EGC 中数量增加。机制上，IL-33 通过上调黏附蛋白 CD34 和 PECAM1 的表达，增强内皮细胞的存活和血管生成。作者还构建了患者来源的 EGC 和 AGC 类器官，证实内皮细胞来源的 IL-33 在体外和体内均能促进 EGC 和 AGC 类器官的生长，且 IL-33 可增加 EGC 类器官中 KRT17 的表达。此外，IL-33 高表达与 EGC 的浸润深度和恶性程度呈正相关，该研究为理解 EGC 的单细胞组成及 IL-33 + 内皮细胞亚群在 EGC 进展中的作用提供了新见解。
01三、研究结果
（一）胃炎至胃癌进展的单细胞图谱
作者整合内部和外部样本集，对 5 例非萎缩性胃炎（NAG）活检样本、14 例慢性萎缩性胃炎 - 肠化生（CAG-IM）活检样本、10 例 EGC 样本、6 例 TNM-II 期样本、5 例 TNM-III 期样本和 2 例 TNM-IV 期样本进行单细胞分析（图 1A）。对每个内部样本，在不预先筛选细胞类型的情况下分离单细胞，采用基于液滴的单细胞 RNA 测序平台生成测序数据，去除低质量细胞后，保留 184,426 个细胞用于后续分析，每个样本平均检测到 3670 个基因，各活检样本的细胞数量见图 1B 及相关补充表格。通过均匀流形逼近与投影（UMAP）分析，获得了从 NAG、CAG-IM 到 EGC 和 AGC 的细胞图谱，最终识别出 8 个主要细胞元集群（上皮细胞、T/NK 细胞、浆细胞、成纤维细胞、B 细胞、肥大细胞、髓系细胞和内皮细胞）及 22 个亚群（图 1B、C）。依据已知标志物表达，确认图谱主要包含上皮细胞（EPCAM、CDH1）、T/NK 细胞（CD3E、CD3D、NKG7、KLRD1）、浆细胞（CD27、CD38）、成纤维细胞（COL3A1、DCN）、B 细胞（CD19、CD79B）、肥大细胞（TPSAB1、CPA3）、髓系细胞（FLT3、CD163、TPSAB1、CD41、CSF3R）和内皮细胞（VWF、CDH5）（图 1D）。作者发现，从胃炎到 AGC，上皮细胞比例逐渐降低，而 T&NK 细胞、B 细胞、浆细胞、成纤维细胞、髓系细胞和内皮细胞的比例随胃癌进展而增加（图 1B）。综上，作者成功构建了胃炎至胃癌进展过程中的单细胞图谱，明确了不同阶段的细胞组成变化，且该变化与胃癌临床发展规律一致。
（二）胃癌上皮细胞的细胞谱系注释
作者对上皮细胞元集群再次进行 UMAP 降维聚类分析，识别出 11 个亚群，包括基底腺黏液细胞（BMCs，以 MUC6、TFF2 为标志物）、主细胞（以 LIPF、PGA3、PGA4 为标志物）、肠上皮细胞（以 FABP1、APOA1 为标志物）、肠内分泌细胞（以 CHGA、CHGB 为标志物）、杯状细胞（以 MUC2、ITLN1 为标志物）、化生干细胞样细胞（MSCs，以 OLFM4、EPHB2、SOX9 为标志物）、壁细胞（以 ATP4A、ATP4B 为标志物）、胃小凹黏液细胞（PMCs，以 MUC5AC、TFF1 为标志物）、胃小凹黏液样细胞（PMC-like，以 SOX4 为标志物）、增殖细胞（PCs，以 MKI67 为标志物）以及癌前细胞（图 2A）。由于癌前细胞在 EGC 活检样本中富集且表达癌症标志物（CEACAM5、CEACAM6），作者将其识别为一个独立集群（图 2B），且该亚群的拷贝数变异（CNVs）数量多于其他亚群（图 2C）。通过相关性计算，作者发现 MSCs（R=0.944）、PMCs（R=0.941）、PCs（R=0.939）与癌前细胞亚群之间存在显著相关性（图 2C）。随后，作者利用 slingshot 分析推断癌前细胞亚群的细胞谱系分化结构和顺序，识别出 7 个不同谱系（图 2D），其中曲线 1 和曲线 2 的分化轨迹涵盖了从 CAG-IM 到 AGC 的谱系变化（图 2E）。随 TNM-IV 期胃癌进展，部分基因表达发生改变，如 KRT18（曲线 1 和曲线 2）和 DEFB1（曲线 2）从 CAG-IM 到 AGC 逐渐增加，OLFM4 在 EGC 中表达显著增加，随胃癌分期升高又急剧下降（图 2F）。癌前细胞亚群中 KRT18（p<0.0001）和 OLFM4（p=0.0435）的表达显著高于其他亚群，DEFB1 虽无统计学差异（p=0.0978），但仍能观察到表达差异（图 2G）。利用 TCGA 数据库中胃腺癌（STAD）数据进行生存分析，发现 KRT18（总生存期（OS），p=0.0073）、DEFB1（OS，p=0.011）高表达分别与 TNM-IV 期患者不良预后相关，OLFM4/OlfD 高表达与 EGC 患者不良预后相关（图 2H）。基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析显示，癌前细胞（曲线 1 和曲线 2）中上调的基因主要富集于抗原加工和呈递通路（图 2H 相关补充图）。此外，作者还对 PCs、MSCs 和 PMC-like 细胞进行了细分和分析，发现部分标志物高表达与胃癌患者不良预后相关（图 2I-K）。综上，作者明确了胃癌上皮细胞的各亚群特征，发现 EGC 中癌前细胞、MSCs、PMC-like 细胞和 PCs 亚群数量增加，并揭示了癌前细胞亚群的分化轨迹及相关基因与患者预后的关联。
（三）T 细胞状态的特征分析
作者首先聚焦 T 细胞，对其进行进一步亚群分析，在 CD4+T 细胞中识别出 8 个集群，包括 CD4 增殖 T 细胞（CD4-Proliferating-T，以 MKI67 为标志物）、CD4 效应 T 细胞（CD4-Te ff，以 CCL5 为标志物）、CD4 效应记忆 T 细胞（CD4-TEM-T，以 IL7R 为标志物）、CD4 调节性 T 细胞（CD4-Regulatory-T，以 FOXP3、CTLA4 为标志物）、CD4 组织驻留记忆 T 细胞（CD4-TRM，以 CD69 为标志物）、CD4-CXCL13 滤泡辅助 T 细胞（CD4-CXCL13-TFH，以 CXCL13 为标志物）、CD4-CCR7 初始 T 细胞（以 CCR7、SELL 为标志物）和 CD4-CH25H+T 细胞（图 3A）。其中，调节性 T 细胞（Treg）和 CCR7 + 初始 T 细胞亚群在 EGC 和 AGC 中比例均增加，而 CH25H+CD4+T 细胞在 EGC 中显著富集（图 3B、C）。耗竭相关基因（PDCD1、LAG3、TIGIT、HAVCR2、CTLA4）在 Treg 细胞和 CH25H+CD4+T 细胞中高表达，在 CCR7 + 初始 T 细胞中低表达（图 3D）。作者还发现 CH25H+CD4 + 亚群同时高表达 FOXO1 和 TNFSF8/CD153，且具有阶段依赖性，在 CAG-IM 和 EGC 中为优势群体（图 3A、B），且该亚群中 CH25H 的表达显著高于其他亚群（图 3E、F）。利用 TIMER 2.0 公共数据库对 STAD 进行免疫浸润分析，发现 CH25H 表达与 CD4+T 细胞和 CD4 + 初始 T 细胞的浸润丰度呈正相关（图 3G）。通过 CellChat 进行细胞间通讯分析，发现上述 CD4+T 细胞亚群（Treg、CCR7 初始 T 细胞、CH25H+CD4+T 细胞）与癌前细胞集群存在密切相互作用（图 3 相关补充图）。生存分析显示，CH25H 高表达与胃癌患者（OS，p=0.0032）和 EGC 患者（TNM-I 期，OS，p=0.044）不良预后相关（图 3H）。在 CD8+T 细胞中，作者识别出 10 个集群，包括早期耗竭 CD8 增殖 T 细胞（以 MKI67、BIRC5、RRM2 为标志物）、CD8 效应记忆 T 细胞（CD8-TEM，以 GZMK、HLA-DRA、HLA-DRB1 为标志物）、CD8-XCL1 组织驻留记忆 T 细胞（CD8-XCL1-TRM，以 XCL1、XCL2、CCL4L2 为标志物）等（图 3I）。随胃癌发生，CD8-TEM 和 GFPT2+CD8+T 细胞比例增加，而黏膜相关恒定 T 细胞（MAIT 细胞）比例降低（图 3K）。CellChat 分析显示，CD4+T 细胞（Treg、CH25H+、CCR7 + 初始）的耗竭表型和 CD8+T 细胞（TEM、MAIT）的活化状态与癌前细胞存在显著细胞间通讯（图 3 相关补充图）。综上，作者明确了 EGC 中 T 细胞各亚群的特征及变化，发现 Treg、CCR7 + 初始 T 细胞、CH25H+CD4+T 细胞、CD8-TEM 和 GFPT2+CD8+T 细胞在 EGC 中比例增加，MAIT 细胞比例降低，且这些 T 细胞亚群与癌前细胞存在相互作用，部分标志物表达与患者预后相关。
（四）胃癌进展中的基质细胞重塑
在成纤维细胞研究方面，作者将成纤维细胞（以 THY1、COL1A2 为标志物）分为 5 个主要集群，包括基质成纤维细胞（CAFmat，以 POSTN 为标志物）、炎性成纤维细胞（CAFinfla，以 PRSS35、MFAP5 为标志物）、脂肪细胞样成纤维细胞（CAFadi）、肌成纤维细胞（CAFmyo）以及新定义的具有上皮-间质转化表型的亚群（CAFEMT，以 KRT19 为标志物），这些集群可进一步分为 8 个亚群（图 4A、B）。AGC 中 CAFinfla 和 CAFEMT 的比例显著增加，而 CAFmat 比例急剧降低（图 4C），且 CAFinfla-PRSS35、CAFinfla-MFAP5 和 CAFEMT-KRT19 亚群在 TNM-IV 期样本中富集，CAFmat-POSTN 亚群在除 TNM-IV 期外的样本中丰富（图 4D）。CellChat 分析显示 CAFmat、CAFinfla、CAFEMT 与癌前细胞存在细胞间通讯（图 4 相关补充图），且 PRSS35 和 MFAP5 在成纤维细胞中特异性表达（图 4E），其高表达与胃癌患者不良预后相关（图 4F）。在内皮细胞研究方面，作者通过亚群分析识别出 7 个内皮细胞集群，包括 FBLN5 + 动脉内皮细胞 - 1（FBLN5+Artery-1）、ADAMTSL2 + 动脉内皮细胞 - 2（ADAMTSL2+Artery-2）、IL-33 + 静脉内皮细胞 - 1（IL-33+Venous-1）等（图 4G）。随胃癌进展，IL-33+Venous-1 和 ADAMTSL2+Artery-2 的相对比例逐渐增加，而 CA4 + 毛细血管内皮细胞 - 2（CA4+Capillary-2）比例显著降低（图 4H、I），且淋巴管内皮细胞几乎在所有 TNM-IV 期样本中均能检测到（图 4H）。IL-33+Venous-1 亚群以高表达 IL-33 和细胞黏附基因（如 MADCAM1、SELP、SELE）为特征（图 4J）。生存分析显示，IL-33、MADCAM1、SELP/CD62P、SELE/ELAM1 高表达与胃癌患者不良预后相关（图 4K）。CellChat 分析显示 IL-33+Venous-1 与 ENPEP + 毛细血管内皮细胞 - 1 存在高强度细胞相互作用，且参与与癌前细胞亚群的细胞通讯（图 4 相关补充图）。作者还发现内皮细胞中 IL-33 的表达显著高于其他细胞（图 4L），且 IL-33+Venous-1 亚群的标志物基因主要富集于免疫应答和细胞黏附通路（图 4M）。综上，作者明确了胃癌进展中成纤维细胞和内皮细胞各亚群的变化特征，发现成纤维细胞在 EGC 中保持稳定，在进展期发生改变，而 IL-33+Venous-1 和 ADAMTSL2+Artery-2 内皮细胞亚群在 EGC 中比例增加，CA4+Capillary-2 比例降低，且 IL-33+Venous-1 亚群与胃癌患者预后相关。
（五）IL-33 驱动内皮细胞血管生成及 IL-33 + 内皮细胞在体外促进 EGC 和 AGC 生长
作者通过免疫组化（IHC）染色分析 EGC 样本中 IL-33 蛋白的表达，发现 IL-33 主要定位于内皮细胞的细胞质和细胞膜中（与内皮细胞标志物 CD31 共定位），且 EGC 和 AGC 中 IL-33 的表达高于 NAG（图 5A）。IL-33 的受体 ST2（IL1RL1）在内皮细胞和肿瘤细胞中均高表达，且其表达随胃癌进展逐渐增加（图 5 相关补充图）。作者随后用慢病毒转染人脐静脉内皮细胞（HUVECs）以敲低或过表达 IL-33（图 5 相关补充图），体外管形成实验显示，过表达 IL-33 可增加分支长度、分支点数、网眼数和毛细血管长度，而敲低 IL-33 则抑制这些参数（图 5B）。此外，IL-33 可促进 HUVECs 的生长（图 5C），减少细胞凋亡（图 5E、F），但不影响其与细胞外基质的黏附（图 5D）。作者从临床 EGC（3 例）和 AGC（3 例）样本中构建类器官（图 5 相关补充图），发现 IL-33 敲低的 HUVECs 条件培养基可抑制 EGC 和 AGC 类器官的生长（图 5G），而重组 IL-33 蛋白则促进两者类器官的生长（图 5H）。综上，作者证实 IL-33 可驱动内皮细胞血管生成，且 IL-33 + 内皮细胞在体外可促进 EGC 和 AGC 类器官的生长。
（六）IL-33 + 内皮细胞在体内促进 EGC 和 AGC 血管生成及生长
作者通过将类器官与 IL-33 调控的 HUVECs 共注射到 SCID 小鼠体内，以检测 IL-33 + 内皮细胞在体内的功能（图 6A），通过 HE 和 IHC 染色识别皮下肿瘤（图 6 相关补充图）。结果显示，在没有 HUVECs 的情况下，EGC 类器官的生长能力低于 AGC 类器官，而内皮细胞可增加肿瘤形成能力（图 6B、C）。过表达 IL-33 的 HUVECs 进一步促进 EGC 和 AGC 类器官的生长（图 6D、F），而敲低 IL-33 的 HUVECs 则产生相反效果（图 6E、G）。超声检查显示，IL-33 敲低组的肿瘤血供较少，坏死较多，且血管主要分布在肿瘤边缘而非肿瘤核心（图 6H）。此外，EGC 肿瘤 IL-33 敲低组的收缩期峰值流速（PSV）和阻力指数（RI）低于 AGC 组（图 6I、J），表明 EGC 的恶性程度低于 AGC。综上，作者通过体内实验证实，IL-33 + 内皮细胞可在体内促进 EGC 和 AGC 类器官的生长及血管生成，且能增加肿瘤的血管滋养和恶性程度。
（七）IL-33 上调内皮细胞和肿瘤细胞中相关黏附分子的表达
作者通过转录组分析阐明 IL-33 在内皮细胞和 EGC 类器官中的作用机制，对比 IL-33 敲低的 HUVECs 与对照 HUVECs，发现 908 个上调基因和 407 个下调基因（图 7 相关补充图），这些差异表达基因（DEGs）主要富集于细胞黏附分子通路（图 7A），与血管生成相关的显著差异基因包括 PECAM1、CD34 和 NRP1/VEGF165R。RT-qPCR 证实 IL-33 可上调 PECAM1 和 CD34 的表达（图 7B），皮下异种移植物的 IHC 染色显示 IL-33 敲低组内皮细胞中 PECAM1 表达降低（图 7 相关补充图），Western blot 分析显示内皮细胞中 PECAM1 和 CD34 的表达与 IL-33 的表达呈正相关（图 7C）。为验证 IL-33 与 EGC 的临床相关性，作者对 41 例临床 EGC 样本（黏膜内癌 38 例，黏膜下癌 3 例）进行组织免疫荧光检测，发现 IL-33 和 CD34 高表达的 EGC 具有更深的浸润深度和更高的病理恶性程度（图 7D）。另一方面，对比 EGC 类器官 IL-33 富集组与对照组的差异表达基因，在 EGC 中识别出 25 个显著上调基因和 29 个显著下调基因（图 7 相关补充图），热图显示 IL-33 可显著上调 EGC 中的 KRT17 基因，显著下调 CCDC184、CDH16、PREX1 和 BVES 基因（图 7E），这些基因主要富集于细胞黏附分子通路和丝裂原活化蛋白（MAP）激酶活性正调控通路（图 7F）。RT-qPCR 和 Western blot 验证了 IL-33 可上调 KRT17 的表达（图 7G、H），皮下异种移植物的 IHC 染色显示 IL-33 敲低组肿瘤细胞中 KRT17 表达降低（图 7 相关补充图）。生存分析显示，ST2、PECAM1、CD34 和 KRT17 高表达预示胃癌患者预后不良（图 7 相关补充图）。综上，作者证实 IL-33 通过自分泌或旁分泌方式上调内皮细胞中 PECAM1 和 CD34 的表达，促进内皮细胞增殖，同时内皮细胞来源的 IL-33 通过增加 KRT17 的表达促进 EGC 生长。
本研究通过单细胞 RNA 测序技术，构建了包含 184,426 个高质量细胞的胃炎至胃癌进展的单细胞图谱，识别出 8 种主要细胞谱系及多个亚群，明确了不同细胞亚群在胃癌进展中的数量变化特征，尤其发现 IL-33+Venous-1 内皮细胞亚群在 EGC 中比例增加。从机制上，证实 IL-33 可通过上调内皮细胞中黏附蛋白 PECAM1 和 CD34 的表达，增强内皮细胞存活和血管生成；同时，内皮细胞来源的 IL-33 能通过上调 EGC 类器官中 KRT17 的表达，在体外和体内促进 EGC 和 AGC 类器官的生长。此外，临床样本分析显示 IL-33 高表达与 EGC 的浸润深度和恶性程度呈正相关，部分基因（如 CH25H、KRT18、PECAM1 等）的表达与胃癌患者预后相关。该研究不仅为理解 EGC 的单细胞组成和肿瘤微环境特征提供了全面视角，还揭示了 IL-33 + 内皮细胞亚群在 EGC 进展中的关键作用，为 EGC 的诊断标志物筛选和治疗靶点开发提供了重要的理论依据
