文章概览
题目：Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq
中文题目：通过单细胞转录组学解析IDH突变型胶质瘤的遗传、谱系和微环境特征
第一作者：Andrew S. Venteicher, Itay Tirosh
通讯作者：Aviv Regev, Mario L. Suvà
日期：2017.3.31
被引次数：436
期刊：Science
影响因子：41.845
引言
在成人中，根据综合遗传和组织学参数将弥漫性胶质瘤分为三大类：IDH-野生型胶质母细胞瘤 (GBM) 是该疾病最普遍和最具侵袭性的形式，而IDH1（或较少见的IDH2 ) 突变包含了两大类神经胶质瘤：星形细胞瘤 (IDH-A) 和少突胶质细胞瘤 (IDH-O) 。IDH-A 和 IDH-O 是两种不同的肿瘤类型，它们的遗传、组织病理学和预后上有所不同。
从遗传上讲，IDH-A 的特征是TP53和ATRX突变，而 IDH-O 的特征是TERT启动子突变和染色体臂 1p 和 19q 丢失。在组织病理学中，IDH-A 和 IDH-O 也是不同的，被认为主要分别概括了星形胶质细胞和少突胶质细胞的分化谱系。少突胶质细胞（例如，OLIG2）和星形胶质细胞（例如，胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)）标志物的表达在这两种疾病中都可以很容易地识别，但在单个肿瘤中，具有肿瘤性星形胶质细胞和少突胶质细胞的组织学特征细胞混合物经常出现。因此，这两种不同胶质瘤独立遵循神经胶质谱系的假设是有问题的。
在这里，作者将 10 个 IDH-A 神经胶质瘤样本的 9879 个细胞（经过质控后保留了 6341 个单细胞）和 6 个 IDH-O 神经胶质瘤样本的 4347 个细胞（先前的研究）的scRNA-seq和 165 个 TCGA bulk RNA-seq相结合，以破译癌细胞基因型和表型，并深入了解 IDH-突变胶质瘤。样本信息如下。
结果发现，IDH-A 和 IDH-O 之间的差异主要是由特定的遗传事件和不同的TME组成来解释的，而不是由两种肿瘤类型的恶性细胞中神经胶质谱系的不同影响来解释的。此外，随着神经胶质瘤分级的增加，我们观察到恶性细胞增殖增强、未分化神经胶质瘤细胞池增多，以及 TME 中巨噬细胞相对于小胶质细胞程序的增加。
本文的研究思路如下：
使用scRNA-seq 破解 IDH 突变胶质瘤样本之间的差异
为了区分恶性细胞和正常细胞，作者使用了层次聚类和CNV结合判断的方法，通过基因表达的层次聚类可以将细胞分成三组：肿瘤细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。通过CNV的预测可以验证恶性细胞判断的准确性。WES和FISH验证了CNV的结果。使用这两个标准，识别 5097 个恶性细胞。
Bulk IDH-A 和 IDH-O 胶质瘤样本间的许多差异并非源于恶性细胞
作者首先使用来自 TCGA 数据集的76 个 IDH-O 和 91 个 IDH-A 胶质瘤的bulk RNA-seq表达谱进行了差异表达分析，发现了约 550 个差异表达的基因，表明存在不同的调控程序。但因为他代表了样本的平均水平，因此作者又进行了恶性细胞单细胞的差异表达分析。但发现bulk RNA-seq中差异表达的基因只有大约一半存在于恶性细胞单细胞的差异表达基因中，说明其他的差异来源于小胶质细胞/巨噬细胞marker基因和神经元marker基因。与 IDH-O 肿瘤相比，IDH-A 肿瘤具有更多的小胶质细胞/巨噬细胞和更少的神经元。
IDH-A 和 IDH-O 恶性细胞间的表达差异大多来源于遗传因素
特定的遗传事件决定了两种胶质瘤的一些差异。比如在 IDH-A 中，恶性细胞中具有较高表达的大多数基因位于染色体 1p 和 19q 上，然而它们在 IDH-O 中是缺失的。CIC基因功能的缺失在IDH-O中具有大约10%的差异，作者还发现p53突变在两者中也起很大作用。
scRNA-seq 揭示了 IDH-A 和 IDH-O 中共享的神经胶质谱系
IDH-A 和 IDH-O 被认为主要分别概括了星形胶质细胞和少突胶质细胞谱系。但是上述结果表明 IDH-A 和 IDH-O 之间的大部分差异可能是由遗传因素和 TME 引起的，不符合这些肿瘤有着不同神经胶质谱系的假设。事实上，作者观察到 IDH-A 和 IDH-O 之间AC的marker基因和OC的marker基因的差异表达有限（图4A）。相反，这些基因的表达在 IDH-A 和 IDH-O 肿瘤中的每一个细胞中有很大差异。减去瘤间差异后，所有 IDH-A 细胞的主成分分析 (PCA) 表明主成分 PC1 和 PC2 与星形胶质细胞特异性 (PC1/2-high) 和少突胶质细胞特异性 (PC1/2-low) 基因相关（图4B）
为了更精确地分类肿瘤细胞，作者定义了胶质细胞谱系基因来区分AC-like和OC-like细胞。这些表达程序使用另外经过10X Genomics测序的3538个IDH-A细胞产生，并且也在IDH-O的细胞中表达（图5）。经过对每种肿瘤中的单个细胞进行这些程序的表达评分，然后使用这些分数对每个程序的优先表达以及中间细胞状态的细胞进行分类（图5C）。可以看到所有肿瘤都表现出广泛的细胞状态分布，但 IDH-A 的中间状态细胞更多。IDH野生型GBM的细胞类型分布与IDH突变型胶质瘤也非常不同，GBM显示出最高的Astro程序偏好性（图5B）。
作者接下来研究IDH-A 和 IDH-O 恶性细胞之间差异表达的 192 个基因是否在所有恶性细胞中共同存在，结果发现，可归因于标志性遗传改变的 109 个基因的表达差异在所有恶性细胞中共享。然而，IDH-A 和 IDH-O 在其余 83 个差异基因的表达在已分化的肿瘤细胞中差异最明显，而在大多数未分化的癌细胞中几乎完全消失（也就是说未分化的细胞差异并不大），这也说明了 IDH-A 和 IDH-O 有着共同的细胞起源的可能性。
为了进一步验证这一假设，我们分析了 整体的 DNA甲基化模式，因为 DNA 甲基化数据会保留基因表达差异不明显的起始细胞的表观遗传特征。作者发现，IDH-A 和 IDH-O 之间的 DNA 甲基化高度相似，尽管 DNA 甲基化受IDH突变的影响很大。
未分化的肿瘤细胞与“增殖”程序和共享的“干性”程序有关
在 IDH-A 和 IDH-O 中，只有一小部分细胞在增殖，而且增殖和分化之间负相关，增殖和干性之间正相关（图6A）。作者将推定的神经胶质瘤干细胞程序定义为在 IDH-A 和 IDH-O 的未分化细胞中富集和共表达的基因子集（图6C）。该程序包括神经发育转录因子（例如 SOX4、SOX11 和 TCF4），并且与人类神经干细胞 (NSC) 和神经祖细胞 (NPC) 的表达程序一致，还与之前在 IDH-O 研究中的程序一致。
染色实验结果表明，AC和OC谱系的marker（APOE和APOD）互斥表达；AC谱系和“增殖”的marker（APOE和Ki67）互斥表达；“增殖”和“干性/祖细胞”的marker（Ki67和SOX9）共表达（图6C）。
与肿瘤分级和遗传亚克隆相关的肿瘤细胞结构的差异
尽管 IDH-A 和 IDH-O 共享相同的干/祖细胞程序和假定的神经胶质分化谱系，但还是可以在组织中观察到区域和肿瘤间的异质性。IDH-A和IDH-O肿瘤的比较揭示三个主要区别：（1）IDH-A中cycling细胞的总体比例更高；（2）IDH-A中未分化细胞的总体比例更高；（3）在IDH-O中，同一个细胞中AC和OC谱系的评分负相关（这与胶质发生中一个谱系会抑制另一个谱系的特征相一致），但这种特征在IDH-A中没有被观察到。
IDH-A 在三个方面都存在与肿瘤分级相关的显着差异，较高级别的肿瘤往往具有更多的cycling细胞、更多的未分化细胞以及AC和OC谱系程序之间更有限的联系（图7A）。通过对大量 TCGA 样本的分析验证了循环恶性细胞的比例与肿瘤等级之间的相关性。
与肿瘤分级相关的特征可能也会在同一肿瘤的不同亚克隆中存在，图7B和7C显示了不同亚克隆的分化模式和cycling细胞比例的不同。
总体来说，这些结果都表明分化和增殖的模式部分收到遗传因素的影响。未来的研究应进一步探究遗传进化对细胞结构有哪些具体影响。
胶质瘤 TME 中的小胶质细胞与巨噬细胞的平衡
作者最后使用 PCA 来分析小胶质细胞/巨噬细胞的多样性，小胶质细胞/巨噬细胞是 TME 中非恶性细胞的主要子集（IDH-A, n = 1043，IDH-O, n = 246）。PC2反映了由细胞因子（白介素IL-1，IL-8，肿瘤坏死因子TNF）、趋化因子 (CCL3 和 CCL4)、NF-κB 相关基因（REL、NFKBIA 和 NFKBIZ）和即刻早期基因（JUNB、FOSB、EGR3、IER3 和 ATF3）组成的炎症程序。该程序在 IDH-A 和 IDH-O 肿瘤中的大多数小胶质细胞/巨噬细胞中都很活跃，并且类似于 IDH-O 中报道的程序。
即刻早期基因（Immediate early genes ， IEGs）细胞经外部刺激后最先表达的一组基因，是联系细胞生化改变与细胞最终对刺激发生特异性反应的中介物。不仅参与细胞的正常生长、分化过程，而且也参与细胞内信息传递过程和细胞的能量代谢过程，在学习记忆中起着极为重要的作用。IEGs不同于“晚期反应”基因，后者只有在早期反应基因产物合成后才会被激活。因此，IEGs被称为“通往基因组反应的门户”。这些基因的激活不需要蛋白质的从头合成。代表基因有Fos, Zif268, Arc, Homer1a等。 这些基因中的一些产物能够把细胞从静止的G0期唤醒，从而进入活跃期。
PC1 突出了两个相互对立的程序，它们与小胶质细胞 (PC1-high) 和巨噬细胞 (PC1-low) 表达程序高度一致（图8A）。高 PC1 基因包括小胶质细胞marker，例如 CX3CR1、P2RY12 和 P2RY13。而 CD163、TGFBI 和 F13A1 属于低 PC1 基因，并且在不同巨噬细胞群中的表达高于小胶质细胞。因此，PC1-high 和 PC1-low 之间的差异可能对应于大脑驻留的小胶质细胞与通过血脑屏障渗透到达肿瘤的浸润性巨噬细胞的不同。
通过小胶质细胞特异性基因与巨噬细胞特异性基因的相对表达对细胞进行评分显示出连续的分布而不是双峰分布（图8B）。因此小胶质细胞和巨噬细胞之间没有明显的分界线。图8C显示了胶质瘤的巨噬细胞与黑色素瘤的肿瘤巨噬细胞（顶部）的巨大差异。因此，胶质瘤微环境可能改变了巨噬细胞的表达谱，从而减少了它们与小胶质细胞的差异。此外，来自每个个体肿瘤的小胶质细胞/巨噬细胞的评分范围有限，一些肿瘤偏向于巨噬细胞-like细胞，（例如 MGH42），而其他肿瘤偏向于小胶质细胞-like细胞（例如 MGH56）（图8C）。这些表明不同肿瘤的微环境的特征由免疫细胞的不同起源决定。
总之，更高级别的胶质瘤对应着更高的比例的巨噬细胞。考虑到血管生成也是更高级别胶质瘤的特征之一，作者发现内皮细胞（血管）的基因表达和巨噬细胞而非小胶质细胞的基因表达相关（图8D, E）。最后，作者通过对 CX3CR1（小胶质细胞）和 CD163（巨噬细胞）进行 RNA 原位杂交验证了我们的观察结果（图8F），结果表明MGH56含有更多小胶质细胞，而没有巨噬细胞，MGH43中小胶质细胞和巨噬细胞的marker都表达，MGH42只有巨噬细胞的marker。最后，与 IDH-O 相比，IDH-A 中小胶质细胞/巨噬细胞的浸润总体增加。
尽管内皮细胞的程序与巨噬细胞的表达程序相关，但并不能完全解释小胶质细胞和巨噬细胞总体比例的变异性。为了寻找与TAM丰度相关的因素，作者在bulk中肿瘤数据中寻找了到了24个在TAM中不表达但与TAM丰度相关的基因，该表达程序可以较好的预测TAM的浸润程度和肿瘤类型，但依然不能确定是否存在因果关系。有趣的是，其中三个基因是补体系统的组成部分，这与在黑色素瘤中成纤维细胞 - 免疫细胞相互作用的类似分析中所观察到的类似。
本文提到的marker基因
OC: MBP, MOBP, PLLP, CLDN11
OC lineage: OLIG2, APOD
AC: GFAP
AC lineage: APOE
Proliferation: MKI67
Stem/progenitor: SOX4
Microglia: CX3CR1, P2RY12, P2RY13
Macrophage: CD163, TGFBI, F13A1
本文的附录S3（aai8478-table-s3.xlsx）列举了肿瘤细胞的marker
参考
https://science.sciencemag.org/content/355/6332/eaai8478
