文章概览
题目：Single-Cell RNA-Seq Analysis of Infiltrating Neoplastic Cells at the Migrating Front of Human Glioblastoma
中文题目：人类胶质母细胞瘤转移边界浸润的恶性细胞的单细胞转录组分析
第一作者：Spyros Darmanis
通讯作者：Stephen R.Quake
日期：2017.10.31
被引次数：297
期刊：Cell Reports
影响因子：8.109
引言
胶质母细胞瘤 (GBM) 是成人中最常见的恶性原发性脑癌 ( Bush et al., 2016 )。先前已经描述了个体 GBM 内肿瘤细胞的患者间变异和分子多样性（Patel et al., 2014)，但迄今为止的研究范围仅限于肿瘤核心细胞的分子复杂性；现有的单细胞分辨率研究无法解决浸润性 GBM 细胞或驻留在 GBM 内部和周围的其他神经元、神经胶质、免疫和血管细胞类型的各种未探索的性质。肿瘤微环境中这些细胞类型中的每一种之间的相互作用可能显着促进肿瘤进展和对治疗的抵抗。
样本信息
作者分别收集了四个IV 级 GBM患者（IDH-wt）两个不同位置处的样本：第一个位于肿瘤核心内（Tumor），第二个来自肿瘤外周（Periphery）。作者使用细胞特异性标记首先对样本中的细胞进行了筛选，特异性地捕获了髓样细胞、少突胶质细胞、（血管）上皮细胞、神经元和星形胶质细胞。测序后通过质控的总共有3,589个细胞。
细胞类型鉴定
作者首先选择了分散程度最高的基因（n = 500），并使用它们构建了细胞间差异矩阵。然后对得到的距离矩阵执行 tSNE。最后，在 2D tSNE 图上使用 k-means 聚类，从而在不同的聚类中识别了 12 种不同的细胞类型（图1）。
恶性细胞中约94%的细胞源自肿瘤核心。这些细胞显着过度表达EGFR，该基因在所有GBM的30%–50%中上调，SOX9是一种在胶质瘤中具有致癌作用的转录因子。有趣的是，EGFR和SOX9这两个基因的联合表达能够以高灵敏度和特异性区分肿瘤细胞。缺氧基因PGK1、CA9、VEGFA、SPP1和HIF1A在肿瘤核心内的表达明显高于周围区域。在2,343个肿瘤核心的细胞中，只有1,029个被鉴定为恶性细胞（~44%）。剩余的绝大多数细胞属于免疫细胞（n=1,182, ~50%）、OPC（n=50, 2.13%），内皮细胞(n=47, 2%)、OC(n=34, ∼1.5%)或神经元(n=1,∼0.05%)。有趣的是，AC是唯一没有在肿瘤核心中找到的正常细胞。
差异表达分析
肿瘤细胞具有将它们与大脑的其他细胞区分开来的共同特征。肿瘤细胞和非肿瘤细胞之间的差异表达分析 (DESeq2) 揭示了所有肿瘤细胞中富集的基因（图2）。
不出所料，EGFR在显示出最高的富集度。NFIB是另一种与大脑发育有关的肿瘤特异性转录因子（Campbell 等人，2008 年，Steele-Perkins 等人，2005 年），在诱导神经干细胞静止和和促进转移（Denny 等人，2016 年）中起重要作用（Martynoga 等人，2013 年）。此外，转录因子SOX2和SOX9 上调，这也涉及大脑发育和谱系形成。SOX2与POU3F2、OLIG2和SALL2基因一起被报道为神经胶质瘤干细胞的标志物（Suvà 等人，2014 年），而SOX9被证明与较差的临床结果相关（Wang 等人， 2012 年）。CHL1是L1神经细胞粘附分子家族的成员，参与发育中的新皮层中神经元的迁移和定位。非肿瘤细胞的基因表达有许多是已知定义成熟、分化的 CNS 细胞类型的基因：MBP 和 OPALIN（OC）、GPR17（OPC）、 L1CAM（神经元），以及 ALDH1L1、WIF1 和 NTSR2（AC）。
接下来作者对免疫检查点相关基因进行了分析。发现大多数肿瘤细胞不表达PD1和CTLA4配体的转录本，而 MHC I 类基因则相反。然而，患者内部和患者之间存在高度异质性。每个患者的肿瘤包括了属于每个不同 Verhaak 分子亚型（Neural, Classical, Mesenchymal, and Proneural subtypes）的细胞集合。
CNV分析
根据每个细胞的CNV谱对细胞进行聚类。得到的树状图由三个主要分支组成（图3A）：CNV1仅由肿瘤细胞组成，而CNV2和CNV3包含大部分非肿瘤细胞。CNV3包含所有CD45+的抗原呈递细胞，CNV2由所有其他非肿瘤细胞组成。CNV2和CNV3分开的最可能原因是6号染色体上MHC II类基因的过度表达。CNV聚类和tSNE聚类判断恶性细胞的结果一致。
肿瘤细胞的CNV 谱揭示了神经胶质瘤中两个已被证实的染色体改变（图3B）：7 号染色体的扩增（包括EGFR ）和10 号染色体的缺失（包括PTEN和MGMT ）（Reifenberger 和 Collins，2004 年）。作者还对BT_S4样本进行了DNA测序，验证了转录组测序的CNV结果。
基因组突变分析
BT_S1和BT_S6样本发现了两个EGFR突变，BT_S4具有MAP1B突变，BT_S2具有TP53突变，具体情况如图4。最上方一行代表样本信息，第二行黑色的代表浸润细胞（位于肿瘤核心外的恶性细胞）。红色表示发生突变，蓝色表示野生型，灰色表示该位置reads覆盖率不足，无法确定。
GBM 浸润细胞分析
尽管肿瘤簇内的绝大多数细胞 (n = 1,029) 是从肿瘤核心收集的，但仍有少数来自外周组织 (n = 62)具有肿瘤特征的细胞（图5A），这些细胞与肿瘤核心的细胞具有相同的CNV变异，表明是从肿瘤核心迁移出来的，称为“浸润细胞（infiltrating cells）”。与位于核心的细胞相比，浸润细胞似乎下调了缺氧基因。
接下来作者对浸润细胞和肿瘤核心细胞做了差异表达分析（图5B）。在浸润细胞富集的前十个基因中，我们发现了具有涉及间质侵袭的基因，例如ATP1A2（也叫FXYD1)和PRODH。浸润细胞还上调表达了细胞存活信号，FGFR3受体以及LMO3可以抑制TP53介导的细胞凋亡。成纤维细胞生长因子(FGF) 信号传导对胚胎发生过程中的细胞迁移很重要，而该通路的重新激活与前列腺肿瘤中的细胞迁移和侵袭有关。
对浸润细胞上调的基因进行GO富集分析，发现与肿瘤细胞迁移高度相关的GO term，例如细胞粘附（ECM2、 ANGPT1和TSPAN7 ）、阴离子转运（TTYH1/2和AQP1）、神经系统发育（ BCAN、 HES6和GLI3）以及许多代谢过程。
GBM 的浸润细胞是否在遍布整个大脑并且发生增殖仍然是一个长期被关注的问题。作者由 MKI67 的表达发现， 7.7% (80/1,029) 的肿瘤核心细胞正在发生增殖，而浸润性细胞仅为 1.6% (1/62)。
免疫细胞分析
免疫细胞主要为巨噬细胞或小胶质细胞（> 95%），其余细胞群主要由树突细胞（DC）组成（~4.5%）。作者利用两组已知的marker来鉴别肿瘤样本和肿瘤外周样本中的巨噬细胞和小胶质细胞。（TMEM119, P2RY12, GPR34, OLFML3, SLC2A5, SALL1, and ADORA3 for microglia and CRIP1, S100A8, S100A9, ANXA1, and CD14 for macrophages)(Bennett et al., 2016)。根据这些基因的综合表达，作者发现在肿瘤核心处，巨噬细胞占大多数（N(macrophage) = 813, N(microglia) = 365）；而在肿瘤外周，小胶质细胞占大多数（N(macrophage) = 85, N(microglia) = 574）。
接下来作者检查了肿瘤核心和外周的差异基因表达（图6B），发现促炎分子在肿瘤外周表达，而抗炎和促血管生成因子在肿瘤核心表达。例如，炎症标志物IL1A/B在肿瘤外周被上调，而IL1RN是IL1A/B的抑制剂，它在肿瘤核心被上调，可以抑制免疫激活。肿瘤核心的免疫细胞中另一个高度富集的基因是TGFBI，TGFBI已被证明可以抑制细胞粘附并促进 DNA损伤细胞的存活，并且是潜在的血管生成因子，因此肿瘤微环境中的免疫细胞可能对肿瘤的生长起到有益作用。肿瘤内的免疫细胞似乎还通过表达血管生成因子VEGFA进一步促进血管通透性和内皮细胞生长。
