Nat Biotech | 高度灵敏地筛选肿瘤新生抗原的方法
原创 榴莲不酥 图灵基因 2021-12-03 16:30
收录于话题#前沿分子生物学技术
撰文：榴莲不酥
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亮点：
本文报告了一种能够高度灵敏地筛选肿瘤（新）抗原的方法——NeoScreen，并产生比迄今为止可能的肿瘤抗原反应性TCR的范围明显更广的库。用NeoScreen鉴定的肿瘤抗原特异性TCR转导的T细胞介导患者来源的异种移植小鼠中已建立的肿瘤的消退，是一种十分有效的肿瘤抗原识别方法。
2021年11月15日，在Nature Biotechnology杂志上发表了一篇名为“Sensitive identification of neoantigens and cognate TCRs in human solid tumors”的文章，报告了一种能够灵敏识别罕见肿瘤（neo）抗原和肿瘤浸润淋巴细胞表达的同源T细胞受体（TCR）的方法——NeoScreen。NeoScreen 代表了一条有价值的管道，可以为癌症疫苗选择相关的私有靶抗原，并为实体瘤的个性化工程 T 细胞治疗分离肿瘤反应性 TCR。
由于对每种肿瘤抗原特异的T细胞频率较低，因此患者特异性肿瘤抗原的鉴定变得复杂。在这里，我们描述了NeoScreen，这是一种能够灵敏识别罕见肿瘤（neo）抗原和肿瘤浸润淋巴细胞表达的同源T细胞受体（TCR）的方法。用NeoScreen鉴定的肿瘤抗原特异性TCR转导的T细胞介导患者来源的异种移植小鼠中已建立的肿瘤的消退。
基于治疗性疫苗接种或靶向肿瘤新抗原的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）转移的癌症免疫疗法已显示出有希望的临床结果。此外，具有肿瘤反应性TCR的血液T细胞工程进一步扩大了过继性T细胞疗法（ACT）的范围。鉴定临床相关的肿瘤抗原及其同源TCRs是此类治疗的关键基础。为此，通常会询问体外扩增的自体TILs和/或外周血淋巴细胞（PBL）以发现肿瘤抗原。然而，PBLs和TILs中新抗原特异性T细胞的频率通常较低，研究团队和先驱已经表明PBL和TIL库是不一致的。此外，尽管先驱工作改进了血液中新抗原反应性的检测，但PBL中的抗原发现仍然具有挑战性。尽管使用TIL可能是有利的，但传统的体外TIL扩增培养方法已被证明会扭曲离体TIL库，因此可能低估了肿瘤反应性淋巴细胞的量化并限制了肿瘤表位的验证。
在该研究中，George Coukos教授团队开发了NeoScreen，这是一种体外TIL扩增和筛选方法，旨在优化抗原验证的灵敏度，并分离罕见的肿瘤抗原特异性CD8T细胞，以便从高度富集的肿瘤抗原特异性CD8T克隆同源TCR细胞。与仅依赖于生长因子白细胞介素（IL）-2的传统培养方法不同，NeoScreen是基于从整个肿瘤片段或从分离的肿瘤细胞中生长的TIL的早期暴露于加载在感受态自体抗原呈递细胞（APCs）上的所选抗原。（图1a）。团队选择CD40激活的（CD40-act）B细胞作为APC，因为它们相对于树突状细胞而言更容易从少量血液中获得和扩增，并且易于通过电穿孔进行设计。因此，装载有不同来源的新抗原的CD40-act B细胞确保了离体对新表位特异性CD8TIL的有效刺激。为了优化APC效力，团队通过共电穿孔编码免疫刺激性4-1BB配体、OX40配体和IL-12的RNA来改造CD40-actB细胞。
图1：APCs的表型和效能
作为原理证明，研究团队首先通过询问来自两个肿瘤标本的TIL来验证Neoscreen方法的贡献，测试了NeoScreen在另外7名患者中揭示新肿瘤抗原的能力。研究通过应用蛋白质基因组学NeoDisc管道方法进行新抗原的预测、基于免疫肽组学的识别和优先排序，专注于非同义体细胞点突变和肿瘤相关抗原（TAA）候选者。在TIL刺激期间，将装载有新抗原和/或TAA候选物的工程自体APC添加一次或两次，并将NeoScreen扩增的TIL与常规TIL培养物进行比较，以了解抗原特异性细胞的存在。NeoScreen能够鉴定7名患者的19个肿瘤表位。对于19个表位中的9个，在NeoScreen中观察到的特定TIL频率明显高于常规培养物，而对于19个表位中的10个，肿瘤抗原特异性TIL仅在NeoScreenTIL中发现。总之，与使用传统策略相比，NeoScreen每位患者的平均肿瘤表位数量为3个。
相对于传统的TIL培养物，NeoScreen TIL对新表位或TAA反应的细胞显著富集了多个数量级。在NeoScreen和常规条件下鉴定的TIL靶向表位的频率增加了约67倍。有趣的是，第二轮TIL刺激进一步增加了它们的频率。值得注意的是，当只考虑新抗原时，NeoScreen仍然明显优于传统策略。此外，与研究团队之前单独使用肽的研究相比，发现NeoScreen得到了显著改善。总体而言，在存在肿瘤抗原的情况下，工程化APC使黑色素瘤和卵巢癌、肺癌和结肠癌中的新抗原特异性CD8T细胞大量扩增，从而建立了一种高度敏感和可重复的方法来识别肿瘤抗原。
图2：敏感肿瘤抗原发现
研究团队接下来的理论是，这个新平台可以敏感地分离针对私人肿瘤抗原的相关TCR。通过使用pMHC多聚体或4-1BB上调纯化肿瘤抗原特异性NeoScreen TIL，并对分离的T细胞进行批量TCRα和TCRβ测序。单个肿瘤表位被一种或多种克隆型识别，在NeoScreen TIL中以不同的频率出现。为了确认肿瘤抗原的特异性识别，将TCRαβ对克隆到受体Jurkat细胞或原代T细胞中，然后通过pmc多聚体或上调4-1BB检测功能性TCR的表达。此外，对通过同源建模获得的三维TCR-pMHC结构的分析表明，所有三个PHLPP2N1186Y-特异性TCR都可以与同源pMHC建立相互作用。
接下来的试验是对大量TIL培养物和离体肿瘤进行了TCRβ测序，确定NeoScreen过程确实通过跟踪原始肿瘤和NeoScreen扩展的TIL中经过验证的TCRβ序列导致肿瘤抗原特异性TIL的显著扩展。有趣的是，虽然在原始肿瘤中检测到TCR-B和TCR-C的频率相似，但在常规TIL中仅发现TCR-B，TCR-C可能在常规培养条件下被稀释或仅在NeoScreen条件。50种克隆型的累积数据证实了NeoScreen有潜力识别对新抗原或TAA具有特异性的新型TCR，这些TCR在常规TIL中未检测到。总体而言，团队在NeoScreen TIL中证明了肿瘤抗原特异性TCR的显著着富集比传统TIL高几个数量级。
图3：肿瘤反应性TCR的识别和验证
尽管新抗原特异性TIL与免疫检查点阻断的临床反应和TILACT相关，但新抗原特异性TCR对自体肿瘤的识别尚未得到一致研究。在原代激活的T细胞中进行TCR克隆后，发现所有NeoScreen衍生的TCR对新表位或TAA具有特异性。据团队所知，这是首次广泛证明新抗原特异性TCR始终针对自体肿瘤。
最后，试验测试了通过NeoScreen识别的TCR可用于基于TCR的个性化ACT的假设。在人IL-2转基因NOG小鼠模型中使用患者来源的异种移植肿瘤，表明过继转移的外周血T细胞转导了从NeoScreenTIL克隆的肿瘤抗原特异性TCR，介导了体内已建立肿瘤的特异性消退。总之，试验证明了通过NeoScreen鉴定的抗原特异性TCR的体外和体内抗肿瘤反应性，这支持使用NeoScreen进行TCR基因转移治疗的可行性。
图4：肿瘤反应性TCR的频率、反应性和疗效
在本研究中，George Coukos教授团队报告了一种能够高度灵敏地筛选肿瘤（新）抗原的方法——NeoScreen，并产生比迄今为止可能的肿瘤抗原反应性TCR的范围明显更广的库。NeoScreen不仅通过增加传统方法发现的抗原特异性TCR的频率起作用，而且还通过募集额外的TCR克隆型，这些TCR克隆型可以以显著增强的灵敏度新检测到。总体而言，NeoScreen能够高效识别黑色素瘤以及卵巢癌、结直肠癌和肺癌中的肿瘤特异性抗原，还能够高度灵敏地分离同源肿瘤反应性TCR。因此，NeoScreen代表了一条有价值的管道，可以为癌症疫苗选择相关的私有靶抗原，并为实体瘤的个性化工程T细胞治疗分离肿瘤反应性TCR。
教授介绍
George Coukos教授既是UNIL CHUV肿瘤学系主任，也是洛桑路德维希癌症研究所所长。作为癌症免疫疗法的先驱，他已成为世界人物之一，George Coukos教授是妇科癌症的专家。特别是，他在费城宾夕法尼亚大学创建了卵巢癌研究中心，并在那里工作了22年。此前，他曾在意大利摩德纳大学医院工作了11年。George Coukos教授拥有多项科学荣誉，在其领域发表了200多篇重要出版物。它得益于多项基金和基金会对其研究发展的支持。研究方向致力于妇科肿瘤免疫治疗和肿瘤微环境的研究。
参考文献
Arnaud M,Chiffelle J, Genolet R, et al. Sensitive identification of neoantigens andcognate TCRs in human solid tumors. Nat Biotechnol. 2021.
