Abstract

45 年前，一名转移性乳腺癌患者的胸腔积液产生了MCF-7 乳腺癌细胞系。 MCF-7 是世界上研究最多的人类乳腺癌细胞系，基于该细胞系的研究结果对乳腺癌的研究和患者治疗产生了根本性的影响。 但是，在使用该细胞系的近 25000 份科学出版物的作者中，有多少人知道其分离和开发的独特故事？在这篇综述中，我们将回顾使用 MCF-7 乳腺癌细胞进行研究的过去、现在和未来。

凯瑟琳·弗朗西斯（Helen Marion） 马伦修女出生于1901 年，就读于密歇根州门罗的圣母无染原罪之心修道院。 1963 年，她因右乳房良性肿瘤接受了乳房切除术，并于1967 年因左乳房腺癌接受了根治性乳房切除术。 根据工业医学之父伯纳迪诺·拉马齐尼(Bernardino Ramazzini) 的早期报告，“修女中发现乳房肿瘤的几率比其他任何女性都要高”，而且随后的流行病学文献表明，未生育过的女性患乳腺癌的几率更高，因此她患上乳腺癌也许并不令人意外。 就在她完成术后胸壁放疗后，发现左胸区域出现局部复发，但据报道，通过三年的放疗和未知类型的激素治疗（可能是己烯雌醇），复发得到了充分控制。 1970 年，Helen Marion 出现胸膜和胸壁转移性疾病，密歇根癌症基金会的研究员 Herbert D. Soule 尝试从胸壁结节切除物和胸腔积液中开发细胞系。当时，许多实验室都记录了产生癌细胞系连续稳定培养物的技术困难，包括成纤维细胞的过度生长，并且有几个实验室尝试使用不同的底物和营养物质分离细胞系。 Soule使用的细胞系开发过程相对标准，来自胸壁结节的细胞培养物很快就被成纤维细胞过度生长并被丢弃。 然而，胸腔积液中的细胞最初在悬浮液中生长，然后最终在塑料上形成单层，并作为连续培养物生长。 由此产生的细胞系被称为 MCF-7，以密歇根癌症基金会的名字命名，代表了 Soule 第七次尝试生成癌细胞系。 迄今为止，已有近 25000 份关于该细胞系的已发表报告，仅次于使用HeLa 细胞系的近 80000 份报告。 MCF-7 细胞系在乳腺癌研究中的受欢迎反映了其在临床环境中对乳腺癌许多方面的忠实度，特别是在治疗患有激素受体阳性乳腺癌的绝经后妇女方面。

MCF-7 和雌激素受体

MCF-7细胞系对乳腺癌研究最重要的贡献之一是其在雌激素受体 (ER) α 研究中的实用性，因为该细胞系是极少数表达大量 ER 的细胞系之一，模仿大多数表达 ER 的侵袭性人类乳腺癌。 值得注意的是，在培养的细胞系中维持雌激素受体α的表达尤其困难，这导致产生比ER阳性的人类乳腺癌细胞系更多的ER阴性细胞系。同样，患者来源的异种移植物（PDX）的开发揭示了产生 ER 阳性 PDX 的困难。 虽然有证据表明细胞外基质和不适当的生长基质（即二维塑料）在培养细胞系中 ER 损失中发挥作用，但Soule 博士似乎没有对当时的标准分离技术进行任何修改来专门分离 ER 阳性细胞系。 相反，ER 阳性MCF-7 细胞系的分离似乎本质上是偶然的。

1973 年对 MCF-7 细胞的最初描述并未提及它们是 ER 阳性的事实。 这一发现被转移到同年的另一份出版物中，其中 Soule 和他的同事报告了“MCF-7 中特定雌激素受体的发现……”；事实上，Soule 在关键的 JNCI 出版物中结束了讨论，他指出，“MCF-7 的生物学特性表明该细胞系是尝试分离人类乳腺癌病毒的绝佳底物”。 在那时，致癌病毒的研究正处于鼎盛时期，但 Soule 和他的同事发表的论文描述了 ER 的存在，这可能对乳腺癌研究产生了最大的影响。 有趣的是，作者认识到这种细胞系对理解ER功能的重要性，因为它提供了“一种稳定的细胞系将允许进行实验，这将增加关于细胞内结合常数、运输机制和核摄取模式的现有知识”，但他们没有提到这种细胞系在激素驱动型乳腺癌研究中的潜力。 回想起来，这是令人惊讶的，因为捐赠者Helen Marion 显然患有激素反应性癌症，并且通过激素治疗得到了控制。 1997 年，即 Soule 博士去世的那一年，Levenson 和 Jordan 撰写了一篇全面的综述，庆祝 MCF-7 细胞问世 25 周年。

Lippman和 Horwitz 最先报道了MCF-7 的 ER 状态和生物学功能，两人都清楚地认识到并阐述了该细胞系在乳腺癌研究中的重要性。 虽然Osborne 和Sutherland 对 MCF-7 的早期研究表明，抗雌激素会导致 G0/G1 阻滞并抑制MCF-7 细胞的生长，但用雌二醇简单刺激生长的证明更具挑战性，而且重现性较差。 解决这一难题对于未来使用MCF-7 细胞进行 ER 功能的研究绝对至关重要。 十多年后，Katzenellenbogens 发现组织培养基中用作pH 指示剂的酚红是一种弱雌激素，在培养基中使用高浓度的酚红时足以激活 ER。 从培养基中去除酚红消除了这一混杂变量，这是允许完全去除雌激素和研究雌激素如何激活ER和刺激生长的关键一步。

MCF-7细胞对ER 抗体的发展至关重要，Greene和他的同事利用从该细胞系中纯化的ER开发了第一个针对人类ER 的单克隆抗体。虽然早期的报道表明ER 是位于细胞质中，在与雌激素结合后易位到细胞核，但ER 抗体的出现澄清了ER 主要的核定位。这些抗体还辅助了鉴定表达ER mRNA的cDNA克隆，并对ESR1基因的克隆和测序起到助力。最近，ER抗体已被用于染色质免疫沉淀（ChIP）来确定靶基因中ER的DNA结合位点。而且，使用抗体来测量人类乳腺肿瘤中的ER水平有助于指导对ER阳性肿瘤进行激素治疗。

尽管 MCF-7 细胞被视为研究雌激素在乳腺癌中作用的“主力”，但值得注意的是，这些细胞还表达雄激素、孕激素和糖皮质激素受体。 由于针对所有这些类固醇信号传导途径的药物也可有效治疗一些转移性乳腺癌患者，因此 MCF-7 细胞也成为了阐明激素反应和抵抗的模型系统。

MCF-7 作为 ER 靶向治疗的模型

MCF-7细胞已经作为体外和体内雌激素响应研究的模型。 雌激素刺激 MCF-7 细胞生长的确切机制仍然是一个活跃的研究领域。早期的报告重点关注雌激素对生长因子信号传导和作用的调节，这无疑是雌激素调节细胞周期的关键组成部分。 但最近的研究表明，雌激素同时诱导和抑制大量基因，这表明存在一个复杂的变化网络，可以协调改变生长。

MCF-7细胞的使用也从根本上指导了激素抵抗的研究。 使用雌激素戒断或长期暴露于抗雌激素的体外研究分离出了MCF-7细胞的激素抗性变体，这些细胞可以是 ER 阳性或 ER 阴性。 雌激素的去除最初会减慢细胞生长，但最终会恢复生长，并且多个实验室已经产生了长期雌激素剥夺（LTED）细胞。Santen 实验室表明，这些细胞表达高水平的 ER，并对雌激素刺激变得高度敏感。 这些研究与开发自己的 MCF-7 LTED 衍生物的其他小组的研究相结合，已经确定这导致了生长因子信号传导改变的表观遗传和转录组变化。 重要的是，虽然从缺乏雌激素的 MCF-7 细胞大量生长获得的 MCF-7 LTED 细胞是 ER 阳性的，但依然可以在其中的单细胞克隆中鉴定出 ER 阳性和 ER 阴性克隆，这强调了临床乳腺癌作为一个整体以及该细胞系的巨大异质性。

许多研究小组还开发出了对抗雌激素——他莫昔芬具有抗药性的 MCF-7 细胞。对这些细胞系的研究表明，生长因子信号传导、上皮间质转化、自噬和其他关键途径发生了变化。 Osborne 及其同事表明，MCF-7异种移植物在体内对他莫昔芬有反应，并且持续暴露于他莫昔芬（在没有雌激素的情况下）会导致细胞响应他莫昔芬而出现刺激生长，Jordan 及其同事也注意到了这一点。 在一项芳香酶抑制剂（阿那曲唑）与他莫昔芬对比组合治疗绝经后早期乳腺癌 (ATAC) 的临床试验中也得到了类似的结果，其中阿那曲唑+ 他莫昔芬的组合仅相当于单独使用他莫昔芬，而且实际上与单独使用阿那曲唑相比更糟糕，这表明在雌激素缺乏的环境中，他莫昔芬实际上被视为 ER 的激动剂。现在已经认识到他莫昔芬刺激的生长是他莫昔芬混合部分拮抗剂/激动剂活性的结果，并且已经进行了详细研究。

MCF-7细胞还为临床前模型中芳香酶抑制剂的研究提供了平台。转染人胎盘芳香酶基因后，所得的MCF-7Ca细胞已被用作绝经后乳腺癌的体内模型，以评估芳香酶抑制剂和抗雌激素的作用。

MCF-7 和HER2

MCF-7细胞没有 HER2 (ErbB2) 癌基因的扩增。但考虑到 HER2 研究模型的缺乏以及 ER 和 HER2 之间潜在的串扰，Osborne和 Benz 生成了过度表达HER2 的 MCF-7 细胞。这些细胞是研究抗 HER2 抑制剂如何阻断生长的优秀模型，并证实了多种抗 HERR2 疗法的活性，这些发现已在临床试验中得到转化和验证。此外，许多实验室已经开发出抗 HER2 治疗耐药的 MCF-7 细胞系，有趣的是其中一种机制是通过ER 的重新激活。

MCF-7 的基因组学和进化

了解 MCF-7 的衍生和分离至关重要，因为有关乳腺癌的基本特征是从这种单细胞系发展而来的。 在最初分离MCF-7的报告中，对第2代胸腔积液的染色体数目进行了评估，发现其范围非常广泛，从70到144。然而，对第39代MCF-7细胞系的分析结果表明，染色体数目已缩小到77至99的范围，独特的干细胞系为88。因此，MCF-7细胞是从最初胸腔积液中根据基因组异质性选出的。值得注意的是，美国典型培养物保藏中心 (ATCC) 提供的MCF-7 细胞中目前的染色体众数为 82 条（范围66 至 87 条）。 尽管培养了45 年，染色体数量仍然相对稳定。

也许实验室中 MCF-7 细胞最令人不安的方面之一是它们随着时间的推移适应和进化的能力。 考虑到它们的基因组不稳定性以及对癌症异质性和进化的日益了解，这一点并不令人意外。 事实上，这种行为模仿了临床乳腺癌，这些乳腺癌也会随着时间的推移在患者体内自发地或在治疗压力下演变。 然而，无法在不同实验室复制 MCF-7 变体的结果引起了人们的担忧。 最初的担忧是交叉污染，这在其他细胞系中已有充分记录，并且仍然是一个主要问题。 事实上，《科学》杂志最近的一篇评论强调了这个普遍问题，并建议采取纠正措施，例如细胞系认证；MCF-7 已引起此类担忧， 奥斯本等人首先报道了ATCC 提供的细胞实际上在细胞遗传学上与 MCF-7 不相似。此外，在确定这个问题时，研究人员还注意到来自不同实验室的 MCF-7 细胞在生物测定中表现不同。这导致许多实验室命名了自己的 MCF-7 变体，这些变体已在文献中报道过，包括 MCF-7L (Lippman)、B (Benz)、KO (Kent Osborne)、BK (Benita Katzenellenbogen) 等等。 现在一些研究表明这些细胞系具有不同的基因表达和基因组谱。 其他人已经注意到MCF-7 细胞变体之间的核型差异，我们自己的工作也显示了来自美国各地实验室的 MCF-7 细胞系之间以及从单一培养物中生长的单个 MCF-7 细胞之间的基因组重排差异 （未发表的数据）。MCF-7在培养物中的这种异质性确实是非常显著的，而且一个在基因组上明显不稳定的细胞系能够持续生长这么长时间也是一个谜。 许多让MCF-7 培养物“度过周末”的学生都会知道这种细胞系的坚固性，因为即使杀死 99% 的细胞，培养的细胞也会反弹。 异质性很可能允许适应不同的生长条件，从而使该细胞系能够保持其核心特性（例如突变和基因重排），而其他不太重要的变化导致了不同微妙变异的出现。

MCF-7已成为许多基因组研究的基本参考细胞系，部分原因是它能够产生无限量的 RNA/DNA 以进行验证和下游功能研究。 例如，大部分ER ChIP 数据来自 MCF-7，第一个全基因组ER-directed DNA looping研究是由在 MCF-7 中的ChIA-PET 进行。 许多研究小组已在 MCF-7 中对 RNA fusions进行了分析，单分子 PACBIO 全转录组数据现已公开。 预计这些泛组学数据（例如 ChIP-seq 和转录组学）的整合将有助于我们进一步了解这种癌细胞系的起源；在未来的许多年里，MCF-7 将继续成为解释 ER 功能和模拟 ER 阳性乳腺癌发生和进展的重要工具。

Conclusion

自 MCF-7 细胞分离以来的 45 年来，使用该细胞系的关键工作仍在继续进行。尽管从组织培养和异种移植物中建立的癌细胞系进行研究存在局限性，但 MCF-7 细胞系的发现从根本上改变了乳腺癌研究的进程，并有助于改善患者的治疗效果。 MCF-7 细胞对于我们理解 ER 功能的价值怎么强调也不为过。 我们预计MCF-7 和其他乳腺癌细胞系尽管存在局限性，但仍将是研究的主要内容。 展望未来，重要的是要确认和验证更多系统中的结果，这些系统纳入了更合适的生长条件，包括常氧和缺氧、三维、张力以及与其他细胞类型共培养的生长。 这些结果将进一步为体内研究提供信息，并继续改善乳腺癌患者的治疗效果。 我们所有人都特别感谢凯瑟琳·弗朗西斯修女[Sister Catherine Frances]和Soule 博士[Herbert D. Soule]，他们的遗产仍在继续发光发热。

参考文献：Adrian V. Lee, Steffi Oesterreich, Nancy E. Davidson, MCF-7 Cells—Changing the Course of Breast Cancer Research and Care for 45 Years, JNCI: Journal of the National Cancer Institute, Volume 107, Issue 7, July 2015.