一、分类
1.按技术的发展
1.1 第一代测序，又称Sanger测序
2.1 第二代测序（Next-gereration sequencing，NGS）
3.1 第三代测序
2.按测序样本种类
2.1 基因组（核酸序列）
（1）全基因组测序（Whole genome sequencing，WGS）
（2）全外显子测序（Whole exon sequencing，WES）
（3）简化基因组测序（Reduced-Representation Genome Sequencing，RRGS）
2.2 转录组（基因表达）
（1）mRNA-Seq：mRNA测序
（2）lncRNA-Seq：长链非编码RNA测序
（3）sRNA-Seq：小RNA测序
二、第一代测序
1.原理
Sanger双脱氧终止法、毛细管电泳法
2.测序平台
ABI 3730、ABI 3500等
3.优点
读长较长（可达1000 bp），准确率高（可达99.999%），是测序的金标准
4.缺点
通量低、成本高
三、第二代测序
1.原理
边合成边测序法、可逆链终止法、连接测序法、焦磷酸测序法
2.测序平台
Illumina HiSeq：边合成边测序法、可逆链终止法
Life Tech：连接测序法
SOLiD：连接测序法
Roche 454：焦磷酸测序法
3.优点
通量高、成本低、时间短、准确率也较高
4.缺点
读长短（不超过600bp），样本制备繁琐
5.Illumina测序流程
Illumina平台采用边合成边测序（Sequencing by Synthesis，SBS）方法，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放不同的荧光，计算机捕捉荧光信号并处理，最终获得DNA的序列信息。
5.1 DNA文库构建
将DNA用超声波打断成碎片（300-500bp），用酶补平末端，3'端加一个A碱基，在DNA两端均加上adapter、index（又称为baccodes）、terminal sequence
5.2 生成簇（Cluster）
（1）将构建好的文库上样至flowcell的lane上，使文库紧密地结合在lane表面上的接头
（2）通过桥式PCR，在lane上形成大量的Cluster
5.3 测序
每个Cluster一次添加一个荧光标记的dNTP，每添加一个dNTP读取一次荧光，计算机检验出相应的碱基
5.4 数据分析
（1）数据初步分析：用fastqc软件进行质量分析
（2）数据过滤（针对接头序列和低质量序列）：常用Trimmomatic
（3）多样本质控：multiqc
四、第三代测序
1.原理
1.1 实时单分子测序技术
中心思想是边合成边测序，反应控制在一个DNA母板链、一个DNA聚合酶、一个相对封闭的反应空间，不同荧光标记的碱基添加上母板显示不同的荧光
1.2 纳米孔单分子通道技术
这个技术的核心是设计出允许单个碱基通过的蛋白纳米孔通道，每种碱基通过通道时对通道电流和两侧电压产生不同影响。通过检测电信号判断碱基的类型。
2.测序平台
PacBio：实时单分子测序
Oxford Nanopore：纳米孔单分子通道测序
3.优点
读长长（1000-10000 bp），样本制备较简单
4.缺点
准确率较低（错误率可达到15%），是三种测序方法中准确率最低的
五、测序数据格式
1.Fastq格式
一般有4行：
第1行：@+序列ID+描述（可选）
第2行：碱基序列
第3行：+描述信息
第4行：序列质量评价
2.Fasta格式
3.Genebank格式
4.EMBL格式
六、总结
