【案例】

使用双酶切的方式将一段基因序列插入pDsRed2-N1质粒中，使其能够与DsRED蛋白进行融合表达。

【1. 序列导入】

pDsRed2-N1质粒可以直接在SnapGene的序列库中找到，导入方式在前面的文章中已经介绍，这里不再赘述。从图谱中选择多克隆位点区域MCS，点击，并转到序列页面：

同时，新建DNA序列，将目的基因的序列粘贴进去，用于后续的酶切位点分析。

敲黑板！！！

【2. 酶切位点分析】

双酶切连接的酶需要满足以下要求：

一、酶切位点需要存在于MCS中，但同时不能存在于目的基因序列中。

二、两个酶切位点之间至少要有几个碱基间隔，不能紧邻或重叠。

三、最好选择成熟的内切酶。

四、结合实验室酶库，最好保证内切酶能在同一最佳缓冲液进行反应

五、双酶切后末端不会发生自连

按照以上原则，我们先看基因中的常见酶切位点：

然后在MCS中排除这些酶切位点：

之后在剩下的酶切位点中，选择常用的即可，因为HindIII、EcoRI两个酶切位点靠的太近，没有选择这两个的组合，以免造成双酶切的效率下降。因此，最终选择的是EcoRI+KpnI的酶切组合。同时，发现EcoRI酶和KpnI酶的最佳NEB反应缓冲液不一样，查看EcoRI酶和KpnI酶的TAKARA双酶切体系，推荐使用TAKARA的M缓冲液。

【3. 调整融合表达的阅读框】

因为目的基因需要融合下游的荧光蛋白进行示踪，所以调整阅读框的通顺性是非常重要的，首先将目的基因中的终止密码子去除，然后将载体上EcoRI+KpnI之间的序列替换为去除终止密码子之后的目的基因的序列：

观察目的基因向下游表达至DsRed2中的氨基酸序列（HGL），发现与DsRed2原始序列（MAS）不同，即发生了移码，完整的阅读框遭到了破坏。因此，我们需要在目的基因下游与KpnI之间添加碱基恢复其阅读框的正确。

从上图中可以看出，当添加了两个碱基之后，之前的两个不同的氨基酸序列合二为一，变为正确的序列，即目的Gene可以跟下游的DsRed2基因进行正确的融合表达了。(如果您的蛋白序列3端不是核心功能区，去掉一个碱基同样可以修复阅读框)