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肿瘤分型文章比较重要的结论就是分型后构建的评分能够预测免疫治疗或者其他治疗的疗效。可以用于分型的基因集很多，比如焦亡，铁死亡，自噬，铜死亡，m7G，细胞衰老等等。
本文是使用bulk数据进行免疫细胞评估，筛选与某种免疫细胞密切相关的基因。如果对本文进行升级呢？第一种方法是我们可以通过单细胞数据识别细胞特异性表达的marker基因，使用某种细胞的marker基因进行分型。第二种方法是我们使用单细胞数据识别细胞特异性表达的marker基因，基于这些基因对bulk数据进行免疫浸润评估，再使用WGCNA识别免疫相关基因进行分型。
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研究概述
肝细胞癌（HCC）是最常见的肝癌组织学类型，是一种高度异质性的恶性肿瘤。由于早期HCC临床症状不明显，70%~80%的患者确诊时已处于晚期，提示预后较差。因此，迫切需要阐明HCC进展的分子机制，开发新的治疗靶标药物以延长患者的生存时间。此外，HCC还是一种典型的免疫原性癌症，巨噬细胞作为HCC免疫微环境的重要组成部分，在机体的先天免疫和后天免疫中发挥着不可替代的作用。
在这项研究中，作者使用生物信息学方法对HCC免疫微环境和免疫细胞类型进行系统分析，以识别巨噬细胞相关基因并区分不同亚型。随后，作者建立了巨噬细胞相关风险特征（MRS）并预测其对HCC患者的预后及化疗和免疫治疗的反应，研究结果将深入了解巨噬细胞对HCC的影响，并有助于提高患者个体化治疗的效率
流程图
研究结果
一、巨噬细胞相关模块的鉴定
1、在TCGA-LIHC队列的10个模块中，黄色模块与巨噬细胞高度相关；在GSE14520队列的8个模块中，黄色模块与巨噬细胞高度相关；在ICGC队列的9个模块中，绿松石模块与巨噬细胞高度相关（下图A-I）。
2、从上述模块的交叉点中鉴定出174个巨噬细胞共表达基因（下图J）。比较肿瘤组织和正常样本之间174个巨噬细胞共表达基因的表达水平，鉴定出69个差异表达的巨噬细胞共表达基因。
3、对174个巨噬细胞共表达基因进行基因本体论（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析。
二、巨噬细胞相关亚型的生物学鉴定
1、基于174个巨噬细胞共表达基因的表达水平将其分为具有不同分子和临床特征的2个不同亚型，包括巨噬细胞相关亚型1中的226个样本和巨噬细胞相关亚型2中的144个样本（下图A-C）。主成分分析（PCA）显示这2个亚型可以通过共表达基因的表达水平很好地区分（下图D）。
2、热图显示亚型1和亚型2中临床病理学特征的分布情况，结果发现2个亚型的肿瘤分期状态和病理分级存在显著差异（下图E）。
3、亚型1中的患者的总生存期（OS）明显优于亚型2中的患者（下图F）。
4、GSVA富集分析表明，亚型1和亚型2之间的富集途径存在差异（下图G）。
5、2个亚型之间共鉴定出2216个差异表达基因（DEG），对上述DEG进行GO富集和KEGG富集分析（下图H-K）。
6、比较2组之间的肿瘤免疫微环境和免疫相关通路的活性差异。结果显示亚型1中的免疫评分、基质评分和综合评分显著低于亚型2，而亚型1中的肿瘤纯度显著高于亚型2。同时，2组亚型之间的免疫细胞相关功能也存在显著差异（下图A-C）。
7、比较2个亚型之间ICI基因和HLA基因的表达差异。结果显示，免疫检查点基因（HAVCR2、VSIR、PDCD1、CTLA4、CD276、CD274、LAG3、NRP1、TIGHT、BTNL2、IDO1、TNFRSF14和VTCN1）和HLA相关基因在亚型2中高度表达（下图D-E）。
8、进行IPS分析以测试巨噬细胞相关亚型预测ICI反应的能力。结果显示，亚型2中的IPS-PD1评分、IPS-CTLA4评分和PD1评分显著高于亚型1，这表明亚型2中的免疫原性更强（下图F-I）。
9、瀑布图显示巨噬细胞相关DEG的突变情况（下图J）。将HCC患者分为低TMB组和高TMB组，Kaplan-Meier曲线表明，高TMB患者的预后比低TMB患者差（下图K-L）。
三、MRS特征的开发和验证
1、使用LASSO和Cox回归分析构建了基于巨噬细胞相关亚型的18基因风险评分特征（MRS）（下图A-C）。
2、利用Kaplan-Meier曲线分析比较上述选定基因的高低表达对预后的影响。结果显示，高风险组患者的OS显著低于低风险组患者（下图D-G）。PCA和t-SNE分析表明，MRS特征显示出良好的辨别力（下图H-M）。
3、风险曲线分析表明，高风险组死亡率较高，生存时间较短；随着风险评分的增加，高风险组的患者数量增加，死亡率增高（下图N-P）。
4、在TCGA队列中，1年、3年和5年OS的AUC分别为0.808、0.749和0.746（下图Q）。与TCGA队列的结果一致，GSE14520队列中1年、3年和5年OS的AUC值分别为0.661、0.681和0.667（下图R）。ICGC队列中1年、3年和5年OS的AUC值分别为0.791、0.780和0.591（下图S）。
5、在TCGA-LIHC队列中，基于巨噬细胞相关亚型的MRS的AUC值显著高于年龄、性别、肿瘤阶段和病理阶段（下图T-V）。
四、MRS的独立预后价值和列线图的构建
1、在TCGA-LIHC队列中，基于巨噬细胞相关亚型的MRS风险评分与临床病理学特征之间存在显著相关性（下图）。
2、Cox回归分析表明，MRS是预测HCC患者生存的独立因素（下图A-F）。决策曲线分析表明，在TCGA-LIHC队列中，MRS的临床预后高于其他临床病理学特征（下图G）。
3、构建列线图以预测HCC的1年、3年和5年生存率（下图H)。校准图显示列线图的预测与实际观察之间保持相对一致（下图I-K）。
五、基于MRS特征的功能分析
1、分析MRS分类的亚型之间基因功能和富集途径的差异。GO通路富集分析显示，DEGs主要集中在生物过程中的“有丝分裂”和“核分裂”。KEGG分析结果显示，DEGs主要富集在与“补体和凝血级联”、“细胞周期”、“视黄醇代谢”等相关通路中（下图）。
2、GSEA富集分析表明，高风险组中最富集的途径是“细胞周期”、“DNA复制”、“ECM受体相互作用”等。GO富集分析表明，高风险组中最富集的生物学过程与“循环免疫球蛋白介导的体液免疫反应”、“吞噬作用”、等密切相关（下图）。
六、高低风险组的肿瘤突变负荷
1、分析MRS中选定基因的基因扩增和缺失频率。结果表明，S100A9、CBX2、STC2、G6PD和PFN2在HCC中具有更高频率的突变（下图A-B）。此外，高风险组中的TMB较高，风险评分与TMB评分呈正相关（图C-D）。
2、生存曲线表明TMB和MRS对HCC患者的生存结果均有所影响（下图E）。瀑布图显示HCC不同风险组之间前20个基因的突变差异，与TMB评分一致，高风险组患者的突变频率较高（下图F-G）。
七、MRS在免疫治疗中的作用
1、比较不同风险组之间HCC免疫亚型的比例。结果表明，不同组之间的免疫表型存在显著差异（下图A-B）。除TDO2外，高风险组ICI基因的表达普遍高于低风险组，提示MRS和ICI基因表达之间存在的相关性（图C-D）。
2、基于TIDE算法评估MRS是否可以作为HCC患者的免疫治疗预测因子。结果显示，TIDE评分与风险评分呈负相关，高风险组的TIDE评分显著低于低风险组，但是高风险组的反应百分比高于低风险组（下图E-G）。
3、在IMvigor210队列中，MRS高风险组显示出更好的生存趋势（下图K）。高风险组和低分析组之间炎症免疫亚型或表达PD-L1的肿瘤浸润免疫细胞的比例没有显著差异（下图H-I）。然而，与低风险组相比，高风险组的肿瘤组织样本中表达PD-L1的肿瘤细胞比例更高（下图J）。与低风险组相比，高风险组的完全缓解/部分缓解百分比更高（下图L-M），同时新抗原计数与风险评分呈正相关。
八、MRS与药物敏感性
1、作者评估了不同MRS特征组之间几种化疗药物的IC50值。药敏结果显示，高风险组中，吉西他滨、博来霉素、顺铂、阿霉素、丝裂霉素C、紫杉醇的IC50值低于低风险组，提示高分析患者可能从上述药物中获益更多。而索拉非尼、雷帕霉素、波舒替尼、达沙替尼、多西他赛和二甲双胍的IC50值在低风险组中较低，这表明低风险患者可能从上述化疗中获益更多（下图）。
总结
在这项研究中，作者筛选出HCC患者的巨噬细胞相关基因模块，并将其划分为不同的巨噬细胞亚型并构建MRS特征，将巨噬细胞相关基因与HCC预后联系起来。同时，作者还评估了MRS高低风险组之间免疫治疗反应和化疗药物敏感性的差异。结果显示，MRS被确定为HCC患者OS的独立危险因素，风险评分与肿瘤分期、病理分级和TNM分期显著相关。上述结果可能有助于加深现阶段对巨噬细胞浸润的理解，并为HCC个性化治疗提供新思路。
