为了研究SARSCoV- 2的感染反应，Youk等人在化学条件下建立了人肺泡干细胞的三维培养模型。他们揭示，SARS-CoV-2有效地感染肺泡2型细胞，导致先天免疫反应。单个细胞的完全感染表现为一次病毒侵入。

• 原代hAT2细胞在化学条件下的长期三维培养
• SARS-CoV-2感染体外hAT2模型后，其超微结构发生了显著变化
• 单细胞RNA-seq发现两种不同的先天免疫表型细胞状态

• 重突变分析揭示了单一的SARS-CoV-2进入hAT2细胞进行完全感染

  
  

严重急性呼吸综合征2型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染人类肺泡2型(hAT2)细胞，是造成当前大流行的原因。确定发病机制对开发疫苗和治疗方法至关重要。然而，由于缺乏反映hAT2细胞生理和病理的模型，限制了研究。在这里，我们开发了一种来自原代人肺组织的hAT2细胞的无气道、长期、三维(3D)培养技术，并研究了对SARSCoV- 2的感染反应。通过基于图像的分析和单细胞转录组分析，我们发现在感染的hAT2细胞中病毒快速复制和干扰素相关基因和促炎基因的表达增加，表明一个强大的内源性先天免疫应答。通过进一步追踪病毒在传播过程中获得的突变，可以有效地识别单个细胞的完全感染。我们的研究为SARS-CoV-2的发病机制和应用定义的3D hAT2培养作为呼吸道疾病模型提供了深入的见解。

在化学条件下长期3D培养hAT2细胞(A)概述我们的h3AC方法的示意图。(B)第27天新鲜分离的hti -280+细胞在培养液(上)和溶出追踪器(下)下的原始人类肺泡2型(hAT2)衍生三维(3D)结构(h3ACs)的代表性图像;红色)。P0,通道0。比例条代表2000毫米(顶部)和1000毫米(底部)。(C)原代h3ACs (P0)中分离的hAT2细胞形成形态异型集落。苏木精和伊红;左)和IF染色(右)为HTII- 280(绿色)、pro-SFTPC(红色)和DAPI(蓝色)。(D)初级h3ACs (P0)折叠和囊状三维结构的量化。提供的数据为三个个体供体样本的平均SEM(供体1 n = 67，供体2 n = 50，供体3 n = 50);n =得分的菌落总数)。(E)表达hti -280(绿色)、F-actin(白色)、CRB3(红色)、DAPI(蓝色)的原代h3ACs IF图像。(F)表示hti -280(绿色)、F-actin(白色)、CRB3(红色)、SCRIB(红色)和DAPI(蓝色)的初级h3ACs IF图像。(G) h3ACs通过单细胞分离在不同时间点连续通过，取决于三个捐赠者的生长情况。每个点代表n = 3个个体供体样本的一个通道，有3个以上的技术复制。(H)测定培养第14天最多9次总传代的h3ACs菌落形成效率(菌落形成效率定义为每个细胞形成的菌落数/包膜细胞数的百分比)。数据以三个个体供体样本(n = 3个生物样本)的平均扫描电镜表示。(I)流式细胞术分析新鲜分离的hti -280+细胞和分离的h3ACs细胞中Lysotracker(深红)摄取情况(P6;培养6个月)。(J)第2代培养的h3ACs 2d电镀诱导hAT1细胞的IF图像。Pro-SFTPC (hAT2，白色)，AGER (hAT1，红色)，AQP5 (hAT1，绿色)，DAPI(蓝色)。Scale bar, 50mm . (K)多个通道(P0，通道1 [P1]和P8)表达pro-SFTPC和TP63的h3ACs量化h3ACs的分类依据是pro-SFTPC (hAT2)、TP63(基础)的IF染色，或两者都缺乏的标记物(pro-SFTPC TP63)。图中显示了每一类菌落所占菌落总数的平均百分比。数据以每个通道的平均SEM表示(P0的n = 131, P1的n = 55, P8的n = 25)。除P8(使用一个供体样本)外，使用了三个供体样本。n =跨通道得分的菌落总数。

人体三维肺泡和支气管培养的SARS-CoV-2感染(A)概述h3ACs和人体三维支气管培养(h3BCs)的SARS-CoV-2感染方法的示意图。为了感染这些模型，收集h3ACs和h3BCs并打碎，暴露腔隙。然后，将h3ACs和h3BCs片段与SARSCoV- 2以0.1或1.0的多重感染(multiplicity of infection, MOI)孵育2小时。(B)在3 dpi时使用SARS-CoV-2感染细胞进行斑块实验的代表性图像。稀释因子显示在右上角。标尺，1厘米。(C)斑块实验显示，在1 dpi时，SARS-CoV-2在h3ACs中活跃复制。数据以平均SEM (n = 2，每个时间点进行两次斑块测定)的形式呈现。2个供体第2代的h3ACs和2个供体第2代的h3BCs被用于空斑分析。(D) qPCR分析测定MOI为0.1和1.0的h3ACs裂解液和MOI为1.0的h3ACs上清中SARS-CoV-2病毒N基因转录本。数据以平均扫描电镜(n = 3，每个时间点进行3次qPCR检测)表示。实验中使用了3个供体第13代的h3ACs和2个供体第2代的h3BCs。(E)感染SARS-CoV-2后2天，Vero细胞存活率显著下降，而h3ACs细胞存活率无显著变化。数据以平均扫描电镜(n = 2，每个时间点的三个发光测量值)表示。实验中使用了来自一个供体的P0处的h3ACs。

SARS-CoV-2感染的h3ACs共聚焦成像(A) h3ACs中ACE2(绿色)和hti -280(红色)IF染色的代表图像。对照h3ACs的所有复制(n = 5来自3个供体的第1代2)均表达ACE2和HTII-280。(B) h3ACs中TMPRSS2(绿色)和pro-SFTPC(红色)IF染色的代表图像。对照h3ACs表达TMPRSS2和pro-SFTPC的所有复制(n = 5在第1段2来自三个捐赠者)。(C) 1 dpi感染h3AC的代表图像。病毒成分(NP或dsRNA;绿色)与pro-SFTPC成本(红色)。在1 dpi时，SARS-CoV-2高度感染h3ACs，显示pro-SFTPC的点状模式。感染h3ACs的n R 5复制;来自三个捐赠者。(D)表达ACE2的感染h3AC的代表图像(红色)。SARS-CoV-2是通过病毒dsRNA(绿色)或NP(绿色)识别的。病毒dsRNA呈点状。感染h3ACs的n R 5复制;来自三个捐赠者。标尺，50毫米。

感染后2天感染h3ACs的透射电镜成像分析(A)感染h3ACs(3例供体10例h3ACs)的低倍放大代表性图像;P2 P3)。红色星号，肺泡间隙;白色箭头，聚集的病毒粒子;白色虚线，hAT2细胞膜。Vc，大的病理空泡;ν,细胞核。(B)观察到层状体(蓝色箭头)。(C)带有高密度SARS-CoV-2颗粒的hAT2细胞。病毒颗粒分散在细胞的细胞质中(红色箭头)。(D)囊状结构中包含的多种病毒颗粒(红色箭头)。(E)病毒颗粒分泌到h3AC的管腔。(F)另一个感染h3AC的部分图像。(G)囊泡结构中的病毒颗粒(红色箭头)。(H)含有病毒的小泡聚集在ER附近(黄色箭头)。(I)位于拉链附近的双膜囊(红色箭头)(黄色箭头)。(J)病毒颗粒分泌到h3AC管腔内(红色箭头)。微绒毛(黑色箭头)显示在hAT2细胞的顶端。标尺，1毫米。

感染h3ACs和h3BCs的rna测序分析(A)三组h3ACs在0、1、3 dpi时最可变的100个基因的热图。(B) h3ACs基因在0和3dpi处的火山图显示差异表达。(C)每百万转录本(TPM)值对感染h3ACs的干扰素基因的转录变化。(D) MX1上调的IF成像(绿色)。感染h3ACs后MX1的浓度明显升高(p值<0.001)。对照组n = 11，感染h3ACs n = 13。(E)病毒RNA在h3AC和h3BC转录组中的读出比例。(F)错义突变的例子(NC_045512.2: 3,177C >U)从h3BC转录组在3dpi检测到。

未感染和感染h3ACs的单细胞转录组分析
(A) UMAP图中数据集的五种实验条件。hpi，感染后数小时。
(B)未感染和感染h3ACs的无监督UMAP聚类。
(C)各实验条件下SARS-CoV-2病毒UMI计数的归一化水平。(D) UMAP图中SARS-CoV-2病毒UMI计数的标准化水平。高度感染的细胞(病毒的UMI计数每10000人的UMI计数R29)大多富集在cluster 6中。
(E)数据集中显示h3ACs一般特征基因的表达情况。

每一簇的基因标记和进入宿主细胞的病毒数量的估计
(A)各聚类高表达的可变基因热图。显示了每个聚类中最显著的可变基因(%10)。Level_CoV2, log2
每10000人的每万人口的每万人口的每万人口的每万人口的每万人口的每万人口的每万人口的每万人口的每万人口;规范化读计数(ðlog2Þ)UMI项一定每10000个人类基因UMI计数。(B)基因的表达在未感染hAT2集群(AQP5),严重感染hAT2集群(HSPA1A) lowIFN_lowCoV2和低收入IFN_mod。CoV2簇(IFI27)和die hAT2s_highCoV2 (PPP1R15A)。(C)单碱基替代(变异等位基因比例[VAF] =原病毒颗粒中4.3%)在每个细胞中的分布。(D)对单一病毒感染细胞比例的最大似然估计。