Genomic instability-derived plasma extracellular vesicle-microRNA signature as a minimally invasive predictor of risk and unfavorable prognosis in breast cancer

基因组不稳定性衍生的血浆胞外囊-MicroRNA特征作为乳腺癌风险和不利预后的微创预测因子

发表期刊：J Nanobiotechnology

发表日期：2021 Jan 12

影响因子：9.429

DOI:  10.1186/s12951-020-00767-3

一、背景

        乳腺癌（BC）是最常被诊断的癌症类型之一，占所有新诊断的女性癌症的30%。在过去的几十年里，BC的发病率基本保持稳定。

        基因组不稳定性（GI）被定义为基因组变化容易增加并能影响表型的过程，并被认为是大多数类型癌症的一个演变标志或特征。GI促进肿瘤间和肿瘤内的异质性，是癌细胞生存、增殖和扩散的主要动力。

        MicroRNA（miRNA）是一种在进化上保守的、单链的、非编码的小RNA，它通过完全或不完全地与目标mRNA结合，诱导mRNA降解或翻译抑制。越来越多的证据强调了miRNA的重要作用，它们是各种生物过程（包括细胞分化、发育和平衡）的重要主调控者。miRNA功能的失调在癌症发病机制中起着重要作用。

二、材料与方法

1、数据来源

1）TCGA：只保留了女性患者的数据，包括配对的miRNA、mRNA表达谱、生存信息和体细胞突变信息，共保留了522个BC样本和355个OV样本

2）GSE22220（n = 210）、GSE73002（n = 3966）和GSE41922（n = 54）

3）血浆外泌体数据集：从中国医学科学院肿瘤医院（CHCAMS）共招募了30名受试者，包括20名BC患者和10名年龄匹配的健康女性，收集这30名受试者的外周血样（10毫升）进行外泌体分离

2、分析流程

1）建立一个miGISig：每个TCGA样本的GI是用癌症基因组内的累积体细胞点突变（CSPM）负担来衡量的，CSPM负担高的肿瘤（排在前25%以内）被定义为基因组不稳定（GU）组，CSPM负担低的肿瘤（排在最后25%以内）被定义为基因组稳定（GS）组；GU样组和GS样组之间差异表达的miRNAs被定义为候选GI相关miRNAs（GImiRs）；使用单变量Cox回归分析确定总生存（OS）时间的预后性GImiRs

2）细胞培养和转染、miRNA模拟物的转染、反转录-定量PCR（RT-qPCR）、细胞增殖试验、流式细胞仪（FACS）分析、免疫荧光染色

3）综合预后指数的构建：通过结合年龄、阶段和miGISig，应用多变量考克斯回归分析来构建综合预后指数

4）miRNAs的靶基因和功能富集分析：实验验证的miRNA-靶点关系来自ENCORI；计算皮尔逊相关系数以衡量miRNA和mRNA之间的相关性；使用DAVID对BC特异性miRNA靶点进行功能富集分析，以确定GO和KEGG途径中显著富集的生物过程（BP）术语

流程图

三、实验结果

01 - 鉴定BC中与GI相关的miRNAs

        使用TCGA-BC队列对GU-like组和GS-like组的miRNA表达进行了差异分析，其中发现了18个差异表达的miRNAs（DEmiRNAs）。其中，与GU样肿瘤相比，GS样肿瘤分别发现14个miRNA上调和4个miRNA下调。基于18个DEmiRNAs表达水平的无监督层次聚类分析产生了两个患者聚类：一个GS样聚类（n = 318）和一个GU样聚类（n = 204）（图1a）。与GS-like组相比，GU-like组的体细胞突变频率明显较高（图1b）。同时，与GS-like组相比，GU-like组的UBQLN4基因表达水平和非整倍体评分明显较高（图1c 、d）。对18个DEmiRNAs特异性mRNA靶点的功能富集分析确定了几个富集的生物过程和途径（图1e、f），包括转化生长因子（TGF）-β、转录调节、有丝分裂细胞周期G1/S转换的负调节和细胞对DNA损伤刺激的反应，以及Notch信号通路，这些都是已知与消化道有关的生物途径。此外，GU样组和GS样组的OS时间有明显差异（图1g）。这些结果表明，这18个DEmiRNAs参与了GI并与BC患者的预后有关。

图1 BC患者GI相关miRNAs的识别和功能特征分析

02 - 开发和验证用于预后风险分层的GI衍生的miRNA特征

        首先使用TCGA发现队列中的单变量和多变量Cox比例危险回归分析了18个GI相关的miRNAs面板，并确定了三个miRNA特征（以下简称miGISig）如下：miGISig得分=（0.501×MIR421表达水平）+（0.6808×MIR128-1表达水平）+（- 0.3617×MIR128-2表达水平）。当按最佳截止值（0.516）分层时，miGISig表现出显著的预后价值，风险组的KM曲线所示，高miGISig表现出不良的预后（图2a）。miGISig驱动的低风险组和高风险组的5年OS率分别为94.8%和63.5%。miGISig的预后价值随后在多个独立的数据集中得到验证，这与最初TCGA发现队列驱动的结果一致。miGISig对生存时间实现了显著或略微显著的区分（图2b, c）。这些结果证明了miGISig在预测BC患者的不利预后方面的强大性能。

        接下来，作者进一步研究了miGISig和CSPM负担，以及非整倍体分数之间的关系。在TCGA-BC队列中，高风险组患者的CSPM负担和非整倍体评分明显高于低风险组患者（图2d）。OV的核心特征之一是GI，计算了TCGA-OV患者的miGISig评分，与TCGA-BC队列中使用的相同。然后根据miGISig得分的中位数将这些患者分为GU样组和GS样组。趋势与BC相似，与GS-like组相比，GU-like组的CSPM负担和非整倍体分数明显更高（图2e）。这些结果强调了miGISig与GI的关联。

图2 miGISig的开发和验证

03 - 建立miRNA-临床预后的复合指标

        作者首先比较了miGISig衍生的高危组和低危组的临床特征，发现ER、PR和TP53突变有明显不同。高miGISig的患者更有可能被描述为ER-/PR阴性和高TP53突变，而ER-/PR阳性和低TP53突变率的患者在miGISig衍生的低风险组中被富集，这表明miGISig与已知的预后因素有额外的关联。因此，为了进一步检查miGISig的预后价值是否独立于这些常见的临床病理因素，采用多变量分析，将miGISig的性能与常见的临床变量进行了测试。结果显示，当对所有BC队列的各种临床因素进行调整后，miGISig和预后不良之间有显著的关联，表明miGISig是预后不良的一个独立预测因素（图S1）。

图S1 不同队列中miGISig与临床特征的多变量分析

        为了进一步提高预后性能，将miGISig与分期和年龄相结合，在TCGA发现队列中拟合了一个多变量的cox回归模型，并建立了一个复合的miRNA-临床预后指标（CMCPI），计算为（0.069×年龄）+（0.527×分期）+（1.363×miGISig得分）。发现队列的CMCPI得分的中位数被用作对患者进行分层的分界值。值得注意的是，在所有BC队列中，CMCPI与预后显著相关，与CMCPI衍生的低风险组患者相比，CMCPI衍生的高风险组的生存时间显著缩短（图3a-c）。

        进一步比较了CMCPI与所有BC队列中的miGISig、年龄和分期。与年龄、分期和miGISig相比，CMCPI在所有BC队列中的5年ROCAU值分别为0.88、0.73和0.70，实现了生存评估的明显改善（图3d-f）。这些结果进一步加强了miGISig与其他重要临床特征相结合的临床意义，在预测BC患者的不良预后方面具有有效的预测性能。

图3 建立和比较CMCPI的性能

04 - miGISig对BC的微创诊断价值

        接下来研究了miGISig在BC风险评估中的表现，首先对MIR421、MIR128-1和MIR128-2在肿瘤和健康对照之间进行了比较表达分析。在TCGA、GSE73002和GSE41922队列中，这三个miRNAs在乳腺肿瘤中的表达量明显高于健康对照组（图4a-c），这表明它们在BC发展中的致癌作用，并强调miGISig在BC风险评估中的潜力。因此，作者评估了miGISig在检测BC患者方面的诊断准确性。在TCGA（AUC = 0.772）、GSE73002（AUC = 0.915）和GSE41922（AUC = 0.794）队列中，尽管GSE41922队列中没有MIR-128-2，但miGISig可以有效区分BC和健康对照（图4d-f），显示了miGISig在BC风险预测中的可靠和强大性能。

图4 miGISig对BC诊断的价值

        为了进一步研究miGISig作为潜在的微创诊断生物标志物的临床适应性，接下来用small RNA-seq分析了这些miRNA在内部30个样本的循环外泌体中的表达水平。与健康人相比，BC患者血清中外泌体miR-128和miR-421的表达水平明显较高（图4g）。此外，用ROC分析评估了外体miR-128和miR-421的诊断价值，结果显示外体miR-128（AUC = 0.825）和miR-421（AUC = 0.835）都是BC风险的重要预测因素（图4h）。此外，所有测试的miRNAs的表达水平在I期的BC患者中也明显较高（图S2A）。I期的BC患者与健康人的AUC分别为0.809和0.773（图S2B）。总之，结果验证并证实了公共BC数据集的计算机研究结果，并强调miGISig可以作为临床上BC早期风险评估的微创诊断生物标志物。

图S2   miGISig 对 BC 早期诊断的价值

05 - miGISig的过量表达通过诱导S期停滞增加基因组不稳定性，并促进乳腺癌细胞的生长

        由于多核和微核是基因毒性和染色体不稳定的生物标志物，作者检测了三种miRNA过表达后多核和微核的频率。首先检测了BC细胞和健康人乳腺上皮细胞184A1和MCF-10A中miR-128-1、miR-128-2和miR-421的表达水平，然后选择了基因组不稳定的非整倍体、MDA-MB-231细胞系，这三个miRNAs的表达水平较低，进行了以下实验（图5a）。将miRNAs模拟物转染到MDA-MB-231细胞并培养48小时，miR-128-1、miR-128-2和miR-421的表达水平明显增加（图5b）。使用高内涵系统，发现miR-128-1、miR-128-2和miR-421的过表达自发地增加了MDA-MB-231细胞系中多核和微核的比例（在miR-128-1、miR-128-2和miR-421，组中分别为25、31和22%，而对照组为18%）（图5c）。

图5 miR128-1、miR128-2和miR421的过量表达促进基因组不稳定，诱导S期停滞并促进乳腺癌细胞的生长

        由于GI可能来自于细胞周期调节的缺陷，还研究了过表达miR-128-1、miR-128-2和miR-421是否导致了细胞周期的异常进展。FACS分析显示，在MDA-MB-231和MCF-7细胞系中使用模拟物过表达这三种miRNA后，处于S期的细胞比例增加，而G2/M期的细胞数量减少（图5d；图S3A和S3B）。与这些结果一致，CCK-8试验表明，过表达miR-128-1、miR-128-2和miR-421后，MDA-MB-231和MCF-7细胞系的增殖能力明显增加（图5e；图S3C）。这些结果表明，miGISig与GI有关，可以作为致癌物促进乳腺癌细胞的生长。

图S3 miR128-1、miR128-2和miR421的过量表达能诱导MCF-7细胞的S期停滞并促进其增殖能力

四、结论

        利用来自肿瘤、健康组织和循环外泌体的全基因组miRNA表达谱，本研究表明了GI相关miRNA的临床价值，并建立了一个GI衍生的3-miRNA特征，允许早期检测和预后风险分层，对 BC 的侵袭性微乎其微。在前瞻性队列研究中进一步调查后，本研究强调了EVs衍生的GI相关miRNAs的潜在临床价值，作为一种微创的基因组学工具来改善BC的精准医疗。