从单个miRNA入手,构建预后模型指导癌症治疗(IF6+)

Comprehensive Analysis of the Prognostic Significance of Hsa-miR-100-5p and Its Related Gene Signature in Stomach Adenocarcinoma

Hsa-miR-100-5p及其相关基因特征在胃腺癌中的预后意义的综合分析

发表期刊:Front Cell Dev Biol

发表日期:2021 Sep 17

DOI:  10.3389/fcell.2021.736274

期刊相关信息

一、背景

        胃癌是世界上第五大最常见的癌症和第三大最常见的癌症死亡原因。大约90%-95%的胃癌是腺癌。手术是唯一的治愈性选择,即使完全切除后,复发也很常见。微核糖核酸(miRNAs)是一种小型的非编码RNA,通过识别同源序列和干扰转录、翻译或表观遗传过程来调节基因表达。

        肿瘤免疫微环境(TIME)是肿瘤所在的细胞环境,由细胞外基质、血液和/或淋巴管、成纤维细胞、免疫细胞和炎症细胞组成。浸润的免疫细胞和癌细胞之间的交叉对话最终导致了一个促进肿瘤发展和入侵的环境。针对TIME主要成分的治疗药物可能会增加改善患者预后的可能性。

二、材料与方法

1.数据来源

1)STAD样本和邻近正常组织的miRNA表达谱从TCGA数据库(TCGA-STAD)和GEO数据库[GSE78091,GSE93415]获得

2)STAD患者的基因表达谱和相应的临床信息来自TCGA和GEO数据库[TCGA-STAD,GSE26253,GSE15460和GSE84437]

2.实验流程

实验流程图

三、实验结果

01 - Hsa-miR-100-5p在胃腺癌样本中下调并与胃腺癌患者的预后有关

        在本研究中,确定了STAD样本和邻近正常组织中差异表达的miRNAs。根据从TCGA-STAD、GSE78091和GSE93415数据集中提取的miRNA表达谱,与正常组织相比,在STAD样本中分别发现了184、37和20个上调的miRNA和94、309和91个下调的miRNAs。作者选择了表达模式相同的重叠的miRNAs。如维恩图所示,hsa-miR-100-5p是唯一在不同表达矩阵中表现出下调表达模式的miRNA(图2A)。通过使用生物样本进一步验证了上述结果,发现hsa-miR-100-5p在胃肿瘤中的相对表达量明显低于邻近正常组织(图2B)。然后,进行了Cox分析,探讨hsa-miR-100-5p的表达与STAD患者的OS和其他多变量临床特征之间的联系,单变量分析显示了一些相关因素:年龄、病理分期、T期、N期、M期,以及hsa-miR-100-5p表达。多变量分析显示,hsa-miR-100-5p表达是STAD患者总生存期的独立风险因素(图2C)。根据最佳分界点,STAD患者被分为低和高的hsa-miR-100-5p表达组。Kaplan-Meier曲线显示,hsa-miR-100-5p高表达的患者比hsa-miR-100-5p低表达的患者的总生存期(图2D)和无病生存期(图2E)更差。这些发现表明,hsa-miR-100-5p可能在STAD的发展中起着关键作用。

图2 hsa-miR-100-5p在胃腺癌(STAD)中的异常表达和预后价值

02 - Hsa-miR-100-5p相关基因的选择和验证,模型的构建

        利用基因表达谱进行WGCNA,以建立一个无标度共表达网络,总共产生了18个基因模块(图3A,B)。在这些基因模块中,蓝色模块与hesa-miR-100-5p表达的相关性最高,被认为是"hesa-miR-100-5p相关模块"(图3C)。此外,与hesa-miR-100-5p表达相关的基因和包含在蓝色模块中的基因之间的关系,包括2669个基因,表现出高度正相关(图3D)。通过检查 "has-miR-100-5p相关模块 "和hsa-miR-100-5p的潜在靶点之间的相互作用,发现271个基因被认为是hsa-miR-100-5p相关的候选基因(图3E)。

图3 miR-100-5p相关候选基因的选择

        作者随后确认271个候选基因是基于TCGA中的STAD样本的强大的hesa-miR-100-5p相关基因,因为这些样本有同步的miRNA和基因表达谱。根据271个候选基因的表达情况,采用共识聚类法将348个样本分成两个聚类,最佳聚类数k为2(图4A)。PCA和UMAP分析表明,这些候选基因具有良好的鉴别能力,两个聚类表现出绝对的不相似性(图4B,C)。此外,两个簇之间的hsa-miR-100-5p的表达水平也有明显的差异(图4D)。因此,这271个候选基因被认为是与hsa-miR-100-5p有关的基因。

图4 验证候选基因为强大的miR-100-5p相关基因

        根据训练队列获得的结果,进行LASSO Cox回归分析,以确定hsa-miR-100-5p相关基因中最可靠的预后基因(图5A),随后进行了10倍交叉验证以克服过拟合效应(图5B)。结果,根据它们各自的系数,留下了一个由九个基因组成的小组(图5C)。图5D显示了涉及训练队列中九个基因的相关网络。多变量Cox回归分析显示,TNFAIP8L1是STAD患者总生存率的一个独立保护因素(图5E)。每个队列中每个患者的hsa-miR-100-5p相关预后风险得分用以下公式计算:风险得分=(LBH×0.03841)+(LETM1×-0. 13428)+(lox× 0.10214)+(cyp1b1 × 0.01567)+(nid2 × 0.02408)+(tnfaip8l1 × -0.13329)+(fzd4 × 0.02059)+(mocs1× 0.04101)+(pdgfrl × 0.02987)。

图5 hsa-miR-100-5p相关预后特征的建立

        然后,根据每个队列的最佳截止风险分数,将患者分配到低风险和高风险组。如图6A所示,对训练队列数据进行的Kaplan-Meier生存分析表明,与低风险组的患者相比,高风险组的患者表现出不利的总生存期。同样,在验证队列和整个队列中,高危组的患者表现出不良的临床结果(图6B,C)。作者进行了单变量和多变量的Cox回归分析,以评估风险特征是否是STAD的独立预后因素。在单变量Cox回归分析中,风险评分的HR和95%置信区间(CI)分别为6.82和3.21-14.47图6D)。在多变量Cox回归分析中,HR为5.82,95%CI为2.45-13.84(图6E)。这些结果表明,hesa-miR-100-5p相关特征与临床特征无关,包括年龄、性别、肿瘤等级和病理分期。为了更好地评估预后特征在预测STAD患者总生存期方面的独特性和易感性,绘制了ROC曲线。如图6F所示,风险评分的AUC值高于临床特征,表明风险评分可以更好地预测STAD患者的预后。

图6 预后特征的验证和评估

        为了提供一个预测STAD患者生存率的定量工具,作者引入了一个包括风险评分和临床特征的nomogram(图7A)。校准曲线显示,3年和5年总生存率的预测值与观察值表现出理想的一致性(图7B)。此外,DCA曲线图表明,在两个不同的时间点,nomogram的表现优于临床特征,如年龄、性别、肿瘤等级和病理分期(图7C)。这些结果表明,nomogram表现出主要的预测能力,可用于改善STAD患者的预后。

图7 预后nomogram的构建和验证

03 - 探讨高风险组和低风险组的潜在调节机制

        为了研究预后特征对STAD的TIME的影响,作者估计了低风险组和高风险组的免疫评分和肿瘤浸润细胞。高危组表现出比低危组更高的免疫分数(图8A)。随后,用TIMER算法评估了每个样本中的免疫细胞类型的比例,结果显示在图8B。比较了两组之间的每种细胞类型,发现高危组中巨噬细胞的比例明显高于低危组,而中性粒细胞和骨髓树突状细胞的比例则呈现相反的趋势(图8C)。通过采用quanTIseq算法,发现M2巨噬细胞的存在而不是M1巨噬细胞的存在导致了高危组的高免疫分数(图8D)。使用CIBERSORT算法,结果显示M2巨噬细胞的存在导致了低风险组和高风险组之间的TIME的显著差异(图8E)。此外,激活的树突状细胞而不是静止的树突状细胞在时间上发挥了重要作用;然而,中性粒细胞的比例在两组之间没有明显差异(图8E)。总之,结果显示,M2巨噬细胞和活化的树突状细胞在STAD的时间中起着关键作用。

图8 调查低风险组和高风险组的TIME

        为了探索导致低风险组和高风险组之间时间差异的潜在调控机制,作者分析了这两组的基因表达谱。与低风险组的相应基因表达水平相比,高风险组共有121个下调基因和2337个上调基因(图9A)。功能注释分析显示,这些基因主要参与细胞外基质组织和受体配体活性(图9B)。KEGG途径分析表明,包括 "神经活性配体-受体相互作用 "和"ECM-受体相互作用"在内的途径明显富含这些基因(图9C)。通过将 "h.all.v7.4.symbols.gmt "中的基因作为参考基因集,进行了GSEA,结果显示,上皮-间质转化和炎症反应等标志物在高危组中明显富集,而DNA修复和未折叠蛋白反应则与低危组动态相关(图9D,E)。

图9 探讨导致低风险组和高风险组之间时间差异的潜在调节机制

04 - 癌症化疗和免疫治疗的预测

        作者比较了低风险组和高风险组之间估计的IC50水平的差异,数据显示多西他赛和顺铂的估计IC50值在低风险组中明显更高,表明高风险组的患者对多西他赛和顺铂化疗更敏感(图10A)。还观察到,低风险组和高风险组之间的PD-L1表达没有明显差异,而低风险组的TMB水平明显高于高风险组(图10B,C)。此外,引入TIDE评分来评估对ICB疗法的反应,低风险评分的患者表现出的TIDE评分低于高风险评分的患者(图10D)。因此,这些发现表明,高风险得分的患者可能对多西他赛和顺铂化疗更敏感,而低风险得分的患者可能更容易从免疫疗法中受益。

图10 化疗和免疫疗法的敏感性预测

05 - Hsa-miR-100-5p相关预后特征的外部验证和Meta分析

        为了验证hsa-miR-100-5p相关预后特征的可靠性,作者使用了另外三个队列,即GSE84437、GSE15460和GSE26253数据集,作为外部验证队列。所建立的基因特征不仅在预测患者的总生存率方面,而且在预测无病生存率方面都显示出良好的性能(图11A-D)。此外,还进行了Kaplan-Meier分析来评估集合队列中的生存差异,以Z-score为零作为分界值,hsa-miR-100-5p相关特征保留了其区分低风险和高风险子集的预后能力(图11E,F)。进行Meta分析以计算预后特征的集合HR和95%CI,结果分别为2.36和1.80-3.08(图11G)。这些结果表明,hesa-miR-100-5p相关的特征是稳健的。

图11 对已建立的hesa-miR-100-5p相关预后特征进行外部验证

四、结论

        作者确定了hsa-miR-100-5p在STAD中的异常表达和预后价值。此外,构建了一个hsa-miR-100-5p相关的预后特征,在预测对化疗和免疫疗法的敏感性方面表现良好,可用于改善STAD患者的预后风险分层。本研究可能有助于制定更加个性化的治疗策略,并改善STAD患者的临床结果。

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