如何从转录组数据中筛选候选基因
前言
转录组分析的最重要目的之一就是筛选候选基因，需要从转录组数据中筛选出跟研究相关的一个或几个候选基因。筛选候选基因的核心是“基因集GSA”，即借助“基因集”的分析先筛选出核心的“基因集”，然后再在上述基因集的基础上，筛选出表达差异大且跟表型显著相关的候选基因；同时后续可以借助基因功能实验验证和模型实验进一步验证上述候选基因对生物学功能影响的真实性。
一、RNA-seq概述
1、RNA-seq分析流程
RNA-seq已经成为转录组范畴内差异基因表达分析至关重要的组学数据，并经常用于监测基因收到干扰的下游后果。目前RNA-seq数据的下游分析主要依赖于预定义的基因集（GSA）(Guo et al.)，例如KEGG/GO和MsigDB等。RNA-seq数据运算的核心是进行DGE分析和富集分析。转录组数据分析的基本流程是：从原始数据获得可分析的表达矩阵—根据生物问题进行数据的进一步筛选—筛选后数据的富集和可视化展示(Teichman et al.) 。RNA-seq数据分析的步骤中包括许多数据类型和文件格式以及各种计算工具。
转录组的基本分析流程包括：数据质控、基因组比对、基因定量、差异分析、基因集分析（GSA）等
RNA-seq测序和数据分析过程中会产生各种类型的文件，常见的转录组文件格式如下所示：从原始数据（FASTQ）到比对参考基因组（FASTA和GFF），以及比对产生的文件（SAM和BAM），以及后续可以用于注释和富集分析的表达矩阵（count和fpkm）。
2.差异基因&基因集（GSA）
经典的转录组分析流程，首先就需要做差异表达分析，然后对鉴定到的差异表达基因进行可视化展示（差异基因散点图、火山图等），常规转录组测序一般进行的单物种内部的差异分析（DGE）旨在通过识别对研究样品施加扰动时有表达变化的基因，进而揭示在这个过程中有重要作用的基因(Julca et al.)；基因集的分类有两种常见的策略：基因表达量变化的分类和基于基因功能的分类。
基于表达量变化的表达模式分析主要包括，趋势分析和WGCNA基因共表达分析；基于基因功能的分类是建立在DGE基础上的富集分析，基于各种已知数据库（GO/KEGG等）对基因的分类，进行基因的富集和筛选。
鉴定差异基因本身并不会有实际的生物学意义，同时不同基因的表达是相互依赖的，因此必须根据功能、相似性、生物学关系或其他相关分类对基因进行聚类，从基因集的角度（GSA）分析差异基因，而不是单纯从单个基因角度进行筛选(Van de Sande et al.)；基因集通常表示集合内的基因同时参与某个信号通路或者具有相关性较高的表达模式，借助已知的数据库（GO/KEGG等）构建基因集和基因间的层次结构，有助于进一步筛选跟研究相关的候选基因。GSA方法（单变量和多变量、监督和无监督），各种GSA方法的性能仅仅取决于所检验的统计假设，由于通路数据库不包括同一基因的不同亚型，因此GSA的分析是基于基因而不是不同转录本亚型(Byron et al.)。
通常来说，两组5 vs 5的差异分析，可以鉴定得到100-1200个范围内的差异基因，从上述差异基因中想要直接筛选出核心基因，可谓是 “大海捞针”，因此就需要借助基因集分析，进一步缩小筛选的范围，常见的针对基因集的分析有：趋势分析和WGCNA分析，fisher富集分析，GSEA富集分析，PPI蛋白互作分析等。
3.ORA和GSEA富集分析
元莘生物分析报告中的富集分析结果是建立在注释到数据库（GO/KEGG）基础上的超几何过表达代表富集分析（ORA）和基因集富集分析（GSEA）：
ORA中，根据上调或下调的差异基因的KEGG/GO注释结果，在某个基因集中差异基因出现频次较高，则认为该基因集被显著富集；ORA分析的缺点是需要人为引入一个临界阈值来定义DE（例如差异倍数和P值，公司采用的值是差异倍数2倍和FDR=0.05）,因此有可能过滤掉一些比较重要的差异基因。
GSEA中，会先确定定义好的基因集（注释到GO/KEGG上的基因）在两组之前是否有统计学意义上的差异；GSEA的主要操作是根据DE水平创建一个基因排名列表，然后测试在相应的基因集中，是否有上调或下调基因的显著富集。
4.WGCNA分析
WGCNA是用来描述不同样品之间基因关联模式的系统生物学方法，可以用来鉴定高度协同变化的基因集，并根据基因集的内连性和基因集与表型之间的关联鉴定候选基因。
趋势分析和WGCNA分析的目的是筛选出高评分的模块（Module），即通过对所有差异基因进行模块分析，将差异基因集分成了一个又一个的模块，并与表型进行显著性关联分析，将数千个基因与表型的关联转换为数个基因集与表型的关联；模块内是高度相关的基因，把基因聚类成模块后，可以对每个模块进行三个层次的分析：1. 功能富集分析查看其功能特征是否与研究目的相符，2. 模块与性状进行关联分析，找出与关注性状相关度最高的模块，3. 模块与样本进行关联分析，找到样品特异高表达的模块。
二、候选基因筛选流程
1.筛选差异基因
通常将log2|Fold change|＞1且q-value＜0.05的基因称为差异表达基因（Differential expression gene, DEG），这个标准可以根据实际得到的差异基因数量进行适当的调整，以获得合适数量的差异基因，得到的差异基因数据包括（显著差异基因和非显著差异基因），这两种数据会用于后续的富集分析。差异分析表达矩阵中，如下数据路径的文件包括了所有显著差异基因（包含上调和下调基因），详细展示了几个重要参数：FC/padj/gene id等：05.expldiff_analysis\known\gene\01.expldiff_identification\Group..degene_all.annot.xls"。
如果样本多于两组，还可以使用venn图展示各个比较足DEG集合的交集和并集，可以清楚看到不同分组DEG的独有性和共有性。
2.Fisher富集分析筛选基因集
一般的筛选逻辑有两个路径
1. 根据数值进行筛选，筛选p value＜0.05和enrich factor 较大的go term或kegg pathway
2. 根据注释关键词进行筛选，筛选注释信息中跟研究功能相关的go term或kegg pathway
一般在富集分析后，就能知道哪些基因被富集到GO term或KEGG pathway下
例如，根据如下参数进行相应筛选，p value＜0.05、enrich fator＞5、gene count＞10和免疫研究相关（关键词：immune）筛选，通过对差异基因GO注释数据库的富集分析表格进行筛选后得到如下信息：
通过上述筛选得到了6个跟免疫反应相关的go term，包括免疫细胞的激活（GO:0002263和GO:0002275）和特定细胞类型肥大细胞（GO:0033006）在免疫应答中的作用，以及适应性免疫反应的调节机制（GO:0002821和GO:0002824），先天免疫反应中的信号传导（GO:0002758）；上述筛选到的功能主要涉及到免疫细胞的识别和信号传递环节。
3.GSEA富集分析筛选关键基因
结合ORA筛选结果和差异基因结果，进行GSEA的进一步筛选，得到如下特定细胞类型肥大细胞（GO:0033006）在免疫应答中的作用，和对应的差异基因。可以针对上述基因进行后续的实验验证。或者再结合文献中的数据进行进一步的数据筛选和整合。
4.WGCNA分析筛选hub gene
为了进一步评估与免疫和炎症反应相关的关键基因，可以进一步进行WGCNA基因共表达分析，如图所示,WGCNA鉴定了21个基因模块，在这些模块中，有两个模块跟炎症反应评分表现出显著相关性，鉴定出45个关键基因。这45个基因中有跟上述ORA和GSEA筛选的基因有重叠部分的基因为：CD84、Fcer1g、CD300a、Fes、Lyn，这5个基因中CD84是免疫细胞间相互作用的关键调节分子；Fcer1g是高亲和力IgE受体的组成部分，对过敏反应至关重要；CD300a是一种免疫抑制受体，调节免疫细胞功能；Fes是非受体型酪氨酸激酶，参与细胞信号传导和细胞命运决定；Lyn是Src家族激酶，对B细胞和T细胞的信号传导起核心作用。
5.文献查找和结果验证
可以借助课题组前期的基因功能实验或文献查阅来借助别人的已经验证过的基因功能结果，之后再根据表达量筛选关键基因；转录组研究的目的就是寻找与实验设计相关的关键基因，一般来说研究某个生理现象都要先阅读大量文献来判断该实验的可行性。
针对上述5个基因,进行基因功能的相关性预测，关联数据包括蛋白质和遗传相互作用、通路、共表达、共定位和蛋白质结构域相似性等，根据预测到的关联性比较紧密的基因进行基因筛选和文献查找结果显示，FCGR3系列基因，可以与IgG结合调控下游的FcεR1γ，并激活SYK-RAS-MAPK 通路（MAPK是重要的蛋白激酶调控通路，其中JNK分支路线跟炎症、凋亡相关），后续可以展开对FCGR3-FcεR1γ-SYK-RAS-MAPK_JNK 通路的调控路径的验证和研究。
三、候选基因筛选汇总
第一步筛选流程：直接根据数值（FC和p值）筛选差异较大的的差异基因，初步查看差异基因的基本情况；
第二步筛选流程：根据ORA富集结果的关键数值（p value、enrich fator、gene count等），结合初步关键词（immune）初步筛选显著富集的基因集；
第三步筛选流程：根据GSEA富集分析结果对第二步筛选结果进行补充，找到显著富集基因集中的关键基因
第四步筛选流程：根据基因共表达分析结果，筛选出重要模块中的基因，结合第三步中的核心差异基因，选择overlap部分的基因。
第五步筛选流程：根据筛选到的基因，查阅相关文献，查看是否有比较重要的基因已经有一些简单的验证和说明，可以进行后续的深入验证和分析。
参考文献
Byron, Sara A., et al. ‘Translating RNA Sequencing into Clinical Diagnostics: Opportunities and Challenges’. Nature Reviews Genetics, vol. 17, no. 5, May 2016, pp. 257–71. www.nature.com, https://doi.org/10.1038/nrg.2016.10.
Guo, Shipeng, et al. ‘GPSAdb: A Comprehensive Web Resource for Interactive Exploration of Genetic Perturbation RNA-Seq Datasets’. Nucleic Acids Research, vol. 51, no. D1, Jan. 2023, pp. D964–68. Silverchair, https://doi.org/10.1093/nar/gkac1066.
Julca, Irene, et al. ‘Toward Kingdom-Wide Analyses of Gene Expression’. Trends in Plant Science, vol. 28, no. 2, Feb. 2023, pp. 235–49. www.cell.com, https://doi.org/10.1016/j.tplants.2022.09.007.
Teichman, Guy, et al. ‘RNAlysis: Analyze Your RNA Sequencing Data without Writing a Single Line of Code’. BMC Biology, vol. 21, no. 1, Apr. 2023, p. 74. Springer Link, https://doi.org/10.1186/s12915-023-01574-6.
‘Temporal Progress of Gene Expression Analysis with RNA-Seq Data: A Review on the Relationship between Computational Methods’. Computational and Structural Biotechnology Journal, vol. 21, Jan. 2023, pp. 86–98. www.sciencedirect.com, https://doi.org/10.1016/j.csbj.2022.11.051.
Van de Sande, Bram, et al. ‘Applications of Single-Cell RNA Sequencing in Drug Discovery and Development’. Nature Reviews Drug Discovery, vol. 22, no. 6, June 2023, pp. 496–520. www.nature.com, https://doi.org/10.1038/s41573-023-00688-4.
Liu, Lei, et al. “Investigating the Role of Inflammatory Response in Polycystic Ovary Syndrome Using Integrated RNA-Seq Analysis.” Journal of Inflammation Research, Dec. 2024. world, www.tandfonline.com, https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.2147/JIR.S460437.
Huang, Chao, et al. “Antibody Fc-Receptor FcεR1γ Stabilizes Cell Surface Receptors in Group 3 Innate Lymphoid Cells and Promotes Anti-Infection Immunity.” Nature Communications, vol. 15, no. 1, July 2024, p. 5981. www.nature.com, https://doi.org/10.1038/s41467-024-50266-4.
