.取材
取材：尽量半小时内完成，因为动物死后半小时蛋白酶开始发挥作用。
大小：1cm1cm0.2cm左右为宜（固定步骤）
切片
冰冻切片：10-20um,
4%甲醛：现配先用
-20取出后晾干15-20min,防止脱片
冰冻切片固定实验 - 实验方法 - 丁香通 (biomart.cn)
问题：如何选择固定液？切片前固定还是切片后固定？
冰冻切片的雷区，你中招了吗？公司新闻丁香通 (biomart.cn)
注意事项：切片之后要立即放入甲醇中；固定液甲醇要用PBS配不能用水。
首先甲醛固定组织，脱水，切片。然后进行以下步骤：
- PBS洗涤：洗涤5min*3-5次，除去包埋剂。
- 晾干，疏水笔画圈，防止抗体派出去
- 通透处理，通透液体加几滴到圈圈中：给固定后的细胞膜打孔（细胞膜蛋白不用这一步）
通透剂有去垢剂和醇类。
去垢剂：tritonx-100,tween
醇类：乙醇和甲醇，醇类对可溶性蛋白和磷酸蛋白有影响，若研究的蛋白是这一类就不适合用醇类作为通透剂。 - 封闭：减少一抗和二抗非靶点结合。常用细胞组织封闭液有5%的山羊血清，或者使用与二抗同物种的血清。也可以将其溶解在PBS里，加入3%的tritonx-100
或者用商品化的封闭液，封闭：15-40min。
加封闭液前先略微清晰通透液，放在PBS的清晰盒子里稍微浸泡几秒钟。
用枪头往圈圈中加封闭液。放入避光片盒中。
5。封闭后不用洗直接进行抗体孵育。
抗体孵育的浓度需要自己摸索。一抗4℃过夜，PBS洗三次，进行二抗孵育。常规室温孵育1-2h。孵育后用PBS洗3次，晾干片子，最后封片。
在圈圈上面及周围滴上封片液（含DAPI，瓶装的），盖上盖玻片。
共聚焦显微镜
三个光源：透视，荧光，激光
荧光：紫激蓝，蓝激绿，绿激红
镜头在标本上的是正置显微镜，在标本下的是倒置显微镜
先开开关再开钥匙
逐行扫描
调整采图角度
1）染料选择：488等
2）.......
