前面小编给大家详细介绍过TCGA这个数据库，以及如何从这个数据库下载，合并表达谱数据。然后做差异表达分析，以及构建ceRNA网络。
最近发现，TCGA的RNAseq数据好像更新了。应该就是在2022年4月初这几天发生的事情。我们来看看具体有那些差别。我们还是以CHOL这套数据为例，来讲解一下如何下载和处理新版TCGA中的RNAseq数据。miRNA的数据并没有变化。
1.打开TCGA官网https://portal.gdc.cancer.gov/。在搜索框输入chol，选择第一个PR（project），TCGA-CHOL
2.在跳转的页面中，点击RNA-Seq后面的数字
3. 在新打开的页面中，点击左上角的Files
4.接下来就是不一样的地方了，可以看到在workflow type里面没有HTSeq-Counts了，取而代之的是STAR-Counts。我们就选择这个STAR-Counts。
你会发现STAR-Counts里面有88个文件，其中44个是Gene Expression Quantification，这是我们合并表达谱所需要的文件。剩下的44文件是Splice Junction Quantification，这个主要是检测新的转录本或者融合的文件。另外这44个文件属于controlled文件，需要申请权限才能下载。
5.勾选Gene Expression Quantification，然后点击右边的Add All Files to Cart。
6. 这个时候在我们的购物车（右上角）里面就会出现刚才选择的44个文件。
我们需要下载这里的sample sheet，点击Sample Sheet。下载下来的文件打开内容如下，可以看到新版TCGA的counts文件的名字不再是带有htseq.counts.gz后缀的压缩文件，变成了star_gene_counts.tsv为后缀的文本文件。
还需要下载所有的包含表达谱数据的star_gene_counts.tsv文件。点击Download, 点击下拉框中的Cart。会下载一个压缩文件。
解压后会是44个文件夹
每个文件夹里面会有一个star_gene_counts.tsv，我们可以随便打开一个看一下，这个文件的内容跟老版本的完全不一样，包含的信息更多。甚至包含了RNA类型，这样就能很容易的区分mRNA和lncRNA了，另外还包含的基因的名字，再也不用担心ID转换问题了。
这里除了有STAR-counts，还有TPM，FPKM和FPKM_UQ。这几个数据的具体计算方法可以参考TCGA官方文档https://docs.gdc.cancer.gov/Data/Bioinformatics_Pipelines/Expression_mRNA_Pipeline/
STAR-counts的计算比较直截了当，就是有几条reads比对到相应的基因上面，counts就是几。
TPM，FPKM和FPKM_UQ的定义如下。
FPKM
The fragments per kilobase of transcript per million mapped reads (FPKM) calculation aims to control for transcript length and overall sequencing quantity.
Upper Quartile FPKM
The upper quartile FPKM (FPKM-UQ) is a modified FPKM calculation in which the protein coding gene in the 75th percentile position is substituted for the sequencing quantity. This is thought to provide a more stable value than including the noisier genes at the extremes.
TPM
The transcripts per million calculation is similar to FPKM, but the difference is that all transcripts are normalized for length first. Then, instead of using the total overall read count as a normalization for size, the sum of the length-normalized transcript values are used as an indicator of size.
TPM，FPKM和FPKM_UQ的计算方法如下。
官网上还给出了详细的例子来帮助大家理解计算过程
Examples
Sample 1: Gene A
Gene length: 3,000 bp
1,000 reads mapped to Gene A
1,000,000 reads mapped to all protein-coding regions
Read count in Sample 1 for 75th percentile gene: 2,000
Number of protein coding genes on autosomes: 19,029
Sum of length-normalized transcript counts: 9,000,000
FPKM for Gene A = 1,000 * 10^9 / (3,000 * 50,000,000) = 6.67
FPKM-UQ for Gene A = 1,000) * 10^9 / (3,000 * 2,000 * 19,029) = 8.76
TPM for Gene A = (1,000 * 1,000 / 3,000) * 1,000,000 / (9,000,000) = 37.04
今天的分享就先到这里，后面我们会给大家介绍如何合并新版本TCGA数据库中的counts得到表达谱矩阵。
