2019-01-12

请教高手我的样品如何去盐更好:低丰度血浆样品,蛋白量约300ug,体积约60ul,因含盐浓度高达160mM,而我的下游分析要求去盐。如用超滤方法有矛盾,过大稀释可能使盐浓度很低,但会造成蛋白损失越大,过小稀释又怕去盐不好。过液相柱又怕蛋白损失,不知还有什么好办法既去盐效果佳蛋白损失又达最小?


将25微克某重组蛋白(最小多聚体分子量>65kD)溶于0.5毫升PBS,过凝胶层析柱,收集液ELISA测定浓度后全部收集约10毫升,Millipore的30kD超滤管回收,浓缩至1毫升,再次ELISA测定,没有了。我个人认为是吸附在膜上了。书上说,截留分子量高的膜吸附较高,但没有具体数值,损失惨重,两千块的重组蛋白,一下子就消失了

感谢pumc506奉献自己宝贵的经验,截留分子量高的超滤管蛋白损失如此大让人触目惊心,但不知您用多少离心力,要提高回收率有一做法是把离心力设在最大离心力的一半。我最近的实验:低丰度血浆蛋白,蛋白量约300ug,体积60ul,但因其缓冲液中含有:

8 M urea, 2% CHAPS,5% acetic acid,150 mM NaCl, 10 mM NaH2PO4.想去掉这些物质,并想最好把缓冲液替代为0.5M的TEAB.

我预实验用3K的millipore超滤管,7000g,分别以1:4和1:7-8的0.5M的TEAB超滤替代,最后蛋白的回收率分别为75%和65%,当然特别耗时。但因每次加1:4的0.5M的TEAB超滤时并没有超滤浓缩至60ul(怕蛋白损失过大),所以如8 M urea最后的浓度也不能以1/5的4次方相乘算,进一步想,就算每次浓缩回至60ul,且蛋白损失也可在接受范围,也不敢保证上面所列要去除的物质基本去除。

故考虑以下手段不知哪个可选择:

1.Zeba™ Desalt Spin Columns,先去盐,其他几种物质是否能去?

2.mini dialysis unit 1K,200ul,先去盐,若不能去掉其他几种物质再超滤。

3.Bio-Rad的Micro Bio-spin column去盐。

4.Cleanup 疏水固相萃取柱,捕获蛋白,再用0.5M的TEAB去溶。

希望园里的高手帮忙啊!

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