这期我们将主要介绍WB实验的显影方法和仪器
显影
Western Blot实验的最后一步，是显影。拿到高特异性、低背景的显色图像，将为实验结论提供强有力的佐证。显色的原理是实验中的二抗被HRP（辣根过氧化物酶）标记，可采用增强化学发光法（ECL）。ECL灵敏度高、重复性好，是目前主流的WB显色方法。
显色方法主要有以下四种：放射自显影，增强化学发光法（ECL），酶促底物DAB显色法和荧光二抗显影法。
其中放射性自显影已经被淘汰，荧光二抗显影法得益于凝胶成像系统的升级，也逐渐开始成为主流，与增强化学发光法（ECL）和酶促底物DAB显色法并列为最常用的三种显色方法。
1. 增强化学发光法（ECL）
在ECL底物中，含有H2O2和鲁米诺（及其衍生物），在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光。ECL与HRP作用显色，稳定性好，灵敏度高，成像性好，对仪器设备无特殊要求，是目前最常用的显影方法。
2. 酶促底物DAB显色法
DAB，3,3'-Diaminobenzidine，是HRP（辣根过氧化物酶）的常用底物，在辣根过氧化物酶的催化下，DAB与双氧水反应产生棕色沉淀，该棕色沉淀不溶于水和乙醇，因此在DAB显色后，还可以使用溶于乙醇的染料进行后续染色。DAB和HRP作用形成褐色不溶性产物，灵敏度和成像性相对较差，且DAB有一定致癌性，使用时要格外注意。
3. 荧光二抗显影法
相比较于传统的显色法和化学发光法只能定性和半定量检测一个蛋白的局限性，荧光WB不仅能在定性的同时实现蛋白定量，还兼容多色荧光抗体的优越性，同时完成二个或者更多蛋白的检测，只要有合适的荧光标记抗体就可以实现荧光WB甚至多色荧光WB检测。
操作上，增强化学发光法（ECL）和酶促底物DAB显色法都有成熟的商业试剂盒在售，将显影液配置好即可进行显影，使用非常便捷；荧光二抗显影法无需使用显影液，只要有合适的荧光标记抗体以及荧光检测设备，即可进行检测。
成像常用仪器和试剂
凝胶图像分析系统
ECL化学发光液的主要成分是鲁米诺（luminol）及异鲁米诺衍生物。鲁米诺和H2O2混合后作为底物，可在HRP的作用下发荧光，利用X光片或化学发光成像系统采集图像。
鲁米诺发光示意图
实验步骤
1、将杂交膜置于化学发光成像仪载物台上；
2、在避光环境中，取等体积（如各取500μL）ECL试剂A液和B液，充分混合；
3、用移液器吸取适量（根据膜的大小，一般1平方厘米约100μL）混合液，均匀滴在杂交膜上，充分湿润；
4、推入载物台后关好门，设置曝光时间拍摄照片（曝光时可设置不同的曝光时间采集图像，从一系列照片中选取曝光效果最佳的图像）。
注意事项
1、采用暗室胶片曝光方法，操作需要尽量熟练，除了要把握曝光时间，还要避免位移（压片、取片过程中胶片和杂交膜不能有移动）；保留好胶片，作为原始凭证；
2、使用化学发光成像仪采集图像，注意采集白光下的图像，并与发光的图像进行融合，作为原始凭证保存。
3、高背景的原因可能是封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够，应降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。
4、出现非特异性条带，原因可能是一抗非特异性与蛋白结合，此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断那一条是目的条带。如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。当然这种情况下有一种很小几率的可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。
5、条带中出现边缘规则的白圈，是因为电转中膜和胶之间存在气泡。应该在转膜前去掉膜和胶之间的气泡
6、如果条带中间出现白色（反白），原因为中心部位高浓度HRP把底物消耗过快，中间部位底物消耗结束之后就不发光了，应降低蛋白量，降低一抗和二抗的浓度。
7、如果条带很亮且背景高，可以减少曝光时间；如果条带很浅，则可适当增加曝光时间；
WB实验显影方法和仪器就讲解到这里了，我们的WB实验合集就讲解到这里了，敬请期待下一个实验合集。
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