详细参考路径为：https://www.dna-asmdb.com/tools/batmeth2-tutorial/bt2-pipeline.html
https://batmeth2-docs.readthedocs.io/en/latest/function/PlotMeth.html
BatMeth2软件介绍：
Batmeth2是一款操作简便的亚硫酸氢盐测序（BS-Seq）分析流程工具包，它可以在允许不同长度插入缺失（Indel）情况下准确地完成亚硫酸测序序列比对。为了方便DNA甲基化数据分析，BatMeth2可以从raw reads测序数据比对到数据可视化、并最后生成HTML可视化报告文件。
相关功能包括：
亚硫酸氢盐测序数据比对；
甲基化水平计算，包括单碱基水平的甲基化水平、基因组区域或者基因转座子等功能区域的甲基化水平；
差异甲基化胞嘧啶/区域（DMC/DMR）检测功能；
甲基化水平可视化。
这些功能可以作为一个全流程使用，也可以分步单独运行，非常有利于亚硫酸氢盐数据分析。
BatMeth2 安装
一、安装要求
GCC(v4.8)，GSL
SAMtools（建议>1.3.1版本）
Fastp，如果将原始数据做为输入文件，需要这个软件，否则不必
Fastp下载：wget http://opengene.org/fastp/fastp
Fastp权限更改: chmod 744 fastp
二、安装Batmeth2的过程
下载软件安装包BatMeth2-master.zip（https://github.com/GuoliangLi-HZAU/BatMeth2）
解压软件安装包BatMeth2-master.zip
将解压后的软件目录“BatMeth2-master”修改为“BatMeth2”
安装过程
cd BatMeth2
./configure
make
make copy
如果不需要gzip格式的进程文件，你可以使用以下过程安装软件：
cd BatMeth2
./configure
make nogzip
make copy-nogzip
BatMeth2的二进制文件将创建于bin目录下
BatMeth2 分析流程
为了更方便地完成DNA甲基化数据分析，我们打包了所有功能，以完成易于使用的自动运行包，用于DNA甲基化分析。在执行BatMeth2期间，会生成有关样本统计信息的html报告。
在进行数据分析前，需要准备基因组和索引文件
首先准备fasta格式的参考基因组
对于WGBS数据，建立索引：
BatMeth2 index -g GENOME.fa
对于RRBS数据，建立索引：
BatMeth2 index_rrbs -g GENOME.fa
数据分析
对于原始数据，运行命令
###### COMMANDBatMeth2 pipel --fastp ~/location/to/fastp -1 Raw_reads_1.fq.gz -2 Raw_read_2.fq.gz -g ./batmeth2index/genome.fa -o meth -p 6 --gff ./gene.gff
经过质量过滤后的数据，运行命令：
###### COMMANDBatMeth2 pipel -1 Clean_reads_1.fq.gz -2 Clean_read_2.fq.gz -g ./batmeth2index/genome.fa -o meth -p 6 --gff ./gene.gff
BatMeth2 分析流程主要包含：测序序列质量过滤、DNA甲基化序列比对、DNA甲基化水平计算、DNA甲基化水平功能注释以及DNA甲基化水平可视化等功能。
主要参数如下：
数据质量控制
--fastp fastp程序路径， 如果未指定--fastp参数，输入文件应该使用质控后的数据
序列比对
--aligner 指定比对程序，默认BatMeth2，可选程序bwa-meth, bsmap, bismark2, no(输出目录下已有比对结果文件)
必要参数
-i 输入文件，如果是双端数据，请使用-1, -2参数，输入文件可以使用逗号分隔
-1 输入文件左端的文件，如果是单端请使用-i参数
-2 输入文件右端的文件
-g 比对使用的参考基因组路径
-p 线程数，默认6
-O 输出结果目录，默认是输出到当前目录下（./）
-o 输出文件的前缀
选用其他比对软件时：
--go 选用其他比对软件（bsmap/bwa-meth/bismark）进行比对时，需指定该软件对应的基因组索引文件
计算甲基化水平
--Qual 当read质量分数>=Q，用于甲基化水平分析,默认是10
--redup 去除PCR冗余，0或者1，默认是0.
--region 设置计算甲基化水平区间大小，可用于后续差异分析，默认参数是1000bp。
-f 对于sam格式输出文件，包含methState属性。[0或者1]，默认为0
--coverage 设置最小的覆盖度，默认是5
--binCover 每个区域最小的nCs，默认是3
--chromstep 染色体使用100000bp的重叠滑动窗口，步长为50000bp。 默认为：50000（bp）
DNA甲基化功能注释
--gtf/--gff/--bed Gtf文件，gff文件或者bed文件
--distance 分布于基因bocy和上下游的DNA甲基化水平。设置上游和下游的距离，默认是2000bp
--step 基因及其两侧序列使用序列长度的5%的重叠滑动窗口，步长为序列长度的2.5%，默认步长为0.025（2.5%）
-C 测序覆盖度不能超过该数值，默认是1000
--coverage 设置最小的覆盖度，默认是5
--binCover 每个区域最小的nCs，默认是3
