2025年11月，广州中医药大学刘中秋/王彩艳/张帆团队在Advanced Science（IF=14.1）上发表了一项题为“Forsythoside E Alleviates Liver Injury by Targeting PKM2 Tetramerization to Promote Macrophage M2 Polarization”的重磅研究。他们从中药连翘中找到了一个名为连翘酯苷E（Forsythoside E，FE）的活性成分，并首次揭示它通过靶向代谢关键酶PKM2，促进其四聚体形成，从而有效缓解脓血症引起的肝损伤。这一发现为天然药物的靶点发现与机制研究树立了新的范式。

标题：连翘酯甘E通过靶向PKM2四聚体化促进巨噬细胞M2极化，缓解肝损伤

发表期刊：Advanced Science

影响因子：14.1

技术路线：首先通过虚拟筛选与分子对接，锁定FE；随后以探针垂钓联合LC-MS在细胞裂解液中捕获并鉴定靶蛋白为PKM2，辅以CETSA与DARTS交叉验证胞内结合，再利用SPR定量其亲和力；在此基础上，通过MST、AFM、DLS、FRET及MD模拟多维度平行比较FE与PKM2 WT/K311A的结合差异，将FE作用位点精确定位于K311残基。

下面，我们就重点从虚拟筛选、CETSA、SPR、分子动力学模拟等关键技术，来深度解读这篇论文。

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一、高通量虚拟筛选：锁定候选分子

研究的第一步，是要在浩如烟海的化合物中找到那个可能起效的分子。研究团队首先通过生物信息学分析，确认了PKM2是脓血症肝损伤的关键靶点——它在患者和模型小鼠的肝脏中均显著高表达。

有了明确的靶点，接下来就是筛选化合物。研究人员采用基于结构的虚拟筛选策略，针对PKM2的变构激活位点，对超过3万个小分子化合物进行了高通量虚拟筛选。经过三轮逐级精筛，根据对接打分，最终锁定了前4名候选化合物，而连翘酯苷E就是其中之一。【分子对接构象】显示，连翘酯苷E(FE)能够很好地嵌入PKM2的激动剂结合口袋，并与关键氨基酸形成稳定的氢键相互作用。这一步的计算筛选，为后续的实验验证指明了方向。

图1 虚拟筛选和分子对接图

二、结合验证：Pull-down+IF+CETSA+DARTS

虚拟筛选结果需经生化实验验证。作者采用交叉结合策略证实FE与PKM2的直接结合。

01、双探针靶点垂钓（Pull-down）

为追踪FE的靶蛋白，作者合成了两种FE衍生物——生物素标记FE（FE-Biotin）和光亲和标记FE。这两种修饰保留了FE的抗炎活性。将探针与RAW264.7细胞裂解液孵育后，利用链霉亲和素磁珠下拉，再经银染和LC-MS/MS鉴定，结果明确检出PKM2特征肽段。Western blot进一步证实下拉产物中富含PKM2蛋白。免疫荧光亦显示FE-Biotin与PKM2在细胞质中共定位。

图2 FE直接靶向PKM2结合验证结果图

02、CETSA+DARTS测定

基于配体结合可增强靶蛋白热稳定性的原理。将FE处理的细胞裂解液进行梯度加热（40-80°C），然后检测残留的可溶性PKM2含量。结果显示，FE显著提高了PKM2的热变性曲线，即在相同温度下，FE处理组PKM2的剩余量明显高于对照组。同时，【药物亲和力响应靶标稳定性（DARTS）】实验也证实FE保护PKM2免受蛋白酶降解。

图3 CETSA与DARTS结果

以上实验相互印证，在体外环境与接近生理状态的细胞环境中，证明了FE与PKM2存在直接且稳定的结合，而非仅计算机模拟的虚拟作用。

三、结合强度评价：SPR+分子动力学模拟(MD)

为了进一步评估FE与PKM2蛋白之间的结合亲和力，研究人员进行了【SPR】实验。结果显示PKM2与FE之间的结合亲和力为277 nM，这一数据远超许多天然产物与靶点间的微摩尔级亲和力，表明FE可以直接且有效地结合PKM2（见图）。此外，SPR的实时传感图还显示结合和解离过程均呈浓度依赖性，符合1:1结合模型，进一步佐证了结合的特异性。

图4 FE与PKM2蛋白SPR结果

【分子动力学模拟】结果表明，FE与PKM2四聚体结合降低了RMSD和RMSF，表明FE增强了PKM2四聚体的稳定性（见图）。更重要的是，当将K311位点突变为丙氨酸（K311A）后，在相同模拟条件下，FE无法降低突变体四聚体的RMSD和RMSF值，即FE的稳定效应被完全消除。这一结果与后续的DLS、FRET等实验完全吻合。MD模拟在此研究中不仅验证了静态结构预测，更从动力学层面解释了FE如何通过结合K311位点，限制四聚体构象的熵增，从而稳固其活性态。

图5 FE与PKM2蛋白的分子动力学模拟结果

四、技术整合：完整的靶点验证证据链

回顾这条研究之路，看到一条清晰的逻辑链：

1、虚拟筛选从海量化合物中高效锁定了候选分子FE；

2、靶点垂钓和CETSA在细胞层面证实了FE与PKM2的直接结合；

3、SPR精确量化了这种结合的亲和力（277 nM）；

4、分子动力学模拟则在原子层面揭示了FE稳定PKM2四聚体的动态机制。

这四项技术的无缝衔接，构成了一套从“虚拟预测”到“体外验证”再到“动态解析” 的完整研究范式。它不仅让连翘酯苷E这一传统中药成分的现代科学内涵得以清晰呈现，更为整个天然产物药物靶点发现领域提供了极具价值的参考。

总结

从一味中药到一种高亲和力的靶向分子，连翘酯苷E的发现之旅，是计算生物学与实验科学交相辉映的典范，也是传统中医药智慧与现代科技深度融合的生动注脚。