10X公司提供两款空间转录组软件，和单细胞对应的软件很相似，最大区别在于增加了空间信息的可视化。那么，如何将空间信息准确定位以及如何将基因表达量准确mapping到空间信息中呢？ Space Ranger结合 Loupe Browser?给出了一套解决方案。
成像算法
Space Ranger依靠图像处理算法来解决与玻片（slide ）图像相关的两个关键问题：
- 确定组织位置
- 校准基准点
需要组织检测来识别哪些捕获点，因此哪些条形码（barcode）将用于分析。由于每个用户在Visium捕获区域成像时可能会因为视角不同而设置不同，数据需要基准对齐，这样Space Ranger就可以知道图像中单个条形码点的位置。
由于图像的尺度和大小是未知的，基准帧的一个未知子集可能被组织或碎片覆盖，每个组织都有其独特的外观，并且图像的曝光可能会随着操作的不同而不同，这些问题使图像定位变得更加困难。
如果这里描述的任何一个过程不能充分执行，用户可以使用Loupe Browser.
的手动对齐和组织选择向导。请注意，在大多数情况下，Space Ranger流程将无法指示发生了图形定位方面的故障，所以鼓励用户检查Space Ranger输出的Web摘要首页上的质量控制图像。
最后，为了使用这里描述的自动分析，图像必须使用左上角的“沙漏”基准来定位:
基准框架
Visium包含一个系统，用于识别打印在每张slide上的特定的不可见捕获点模式，以及这些模式与围绕每个捕获区域形成框架的可见基准点之间的关系。基准框架具有软件试图识别的独特的角和边。
这个过程首先提取“看起来”像基准点的特征，然后尝试将这些候选基准点与已知的基准点模式对齐。从图像中提取的斑点必然会包含一些遗漏，例如在基准斑点被组织覆盖的地方，以及一些误报，例如在slide上的碎片或组织特征可能看起来像基准斑点的地方。
在从图像中提取假定的基准点之后，该模式与已知的基准点模式对齐，其方式对一定数量的假阳性和假阴性具有鲁棒性。这个过程的输出是一个坐标转换，它将Visium条形码斑点模式与用户的组织图像联系起来。
组织检测
Visium 片中的每个区域都包含一个包含4992个捕获点的网格，网格中填充了用于捕获聚腺苷酸mRNA的空间条形码探针。实际上，这些斑点只有一小部分被组织覆盖。为了将Space Ranger的分析限制在那些放置了组织的点上，Space Ranger使用一种算法来识别输入的brightfield图像中的组织。
使用输入图像的灰度、下采样版本，计算和比较组织切片放置的多个估计值。这些估计值用于训练统计分类器将捕获区域内的每个像素标记为组织还是背景。
下面的质量控制图像显示了这个过程的结果。确定为组织的单个图像像素的颜色为淡蓝色。不可见的捕获点的位置在背景上用灰色圆圈表示，在组织上用深蓝色圆点表示。
为了获得最优的结果，该算法期望得到的图像具有平滑、明亮的背景和较暗、结构复杂的组织。如果用蓝色绘制的区域与组织不一致，您可以在运行Space Ranger之前在 Loupe Browser中执行手动对齐和组织选择。有关如何改进图像输入以获得更好的结果的信息，请参阅故障排除部分：troubleshooting。
借助 Loupe Browser 认为校准
Space Ranger 使用自动图像检测算法（ automatic image detection algorithms）来计算基准标记的位置，并找到组织的边界。10x Genomics在各种图像、组织和样本上测试算法，发现检测算法是稳健的。然而，在某些情况下，基准标记是模糊的，或者检测到的轮廓不是组织边界的确切位置。此外，某些组织，特别是那些有孔洞或缝隙的组织，可能需要更多的微调，以避免在下游分析中包括背景点。
Loupe Browser 4.0及以后版本为需要更多手动干预的情况提供了Visium手动对齐功能。该向导使得以交互方式将图像对齐到slide的基准标记位置成为可能，使用一套工具执行组织选择，并将手动对齐导出到Space Ranger运行中。本教程将逐步介绍这个过程。
输入定位信息
Visium手动对齐向导可以在Loupe浏览器的开始页面中找到，位于左下角，在Align a Visium Image下。
单击链接将启动向导。向导的第一页显示Visium载玻片的示意图，包括载玻片上序列号的位置，以及载玻片上每个捕获区域的位置。
由于点的位置在不同的载玻片和不同的捕捉区域之间会有细微的变化，为图像提供正确的幻灯片和捕捉区域信息可以确保最准确的定位和点的位置。
接下来，单击** Input Alignment Data **， 打开 Input Data页面，其中包含加载图像的提示，并输入载玻片和捕获区域信息。
The rest of the tutorial assumes the following resources:
- Image: Download
- Slide serial: V19L29-035
- Capture area: A1
下载的是JPG格式的图片。
打开图片
Visium手动对齐向导接受与Space Ranger相同类型的图像文件，包括:
- TIFF or BigTIFF images with 8 bytes per channel, color
- TIFF for BigTIFF images with 16 bytes per channel, grayscale
- JPEG images
单击Open Image打开一个文件对话框，对当前文件系统进行筛选，寻找兼容的图像文件。选择一个文件会触发一个简短的加载过程（这只可能发生在非常大的图像）。如果运行向导的计算机没有足够的RAM来有效地加载映像，则需要确认向导才能继续。
图片载入后，是这样的：
载玻片信息
输入载玻片信息有三种选择。
- 默认情况下，即直接输入slide序列号和拍摄图像的捕获区域，是首选的机制。此选项需要连网，因为最新的slide信息是从10x下载的。(对于离线选项，请继续阅读。)在slide序列号文本框中输入序列号(本教程中为V19L29-035)并按下“下载”按钮将验证序列号并加载slide信息。如果slide号无效，或者没有互联网连接，程序将显示一个提示。捕获区域选择器在成功输入后可见。选择捕获区域将解锁“开Start Alignment Process”按钮，然后执行下一步。
下载完是这样的：
第二个选项更适合脱机模式，如果映像slide的点偏移文件在本地可用。单击打开的slide文件提示此类文件，其中格式为slide系列。gpr，如V19L29-035.gpr。一旦文件被加载和验证，捕获区域选择器是可见的。选择捕获区域将解锁“Start Alignment Process”按钮，然后执行下一步。
最后，如果图像的序列号和捕获区域未知或点偏移文件不可用，仍然可以使用第三个选项进行手动对齐。Visium手动对齐向导在对齐步骤中使用理想的网格布局，而不是特定于slide的点偏移文件。从理想网格到实际滑动位置的每个点的增量可能在5-15微米之间，明显小于每个点的宽度。虽然光斑精度有所下降，但光斑与底层图像之间的关系仍然是一致的。
将点（Spots）与图像对齐
使用图像中的点位置信息和上一步中加载的点偏移文件来启用交互式手动对齐，使用基准标记作为视觉指南。这些点与图像对齐，首先以粗粒度的方式识别基准标记的中心，然后以细粒度的方式通过拖动进行小的调整。
对齐说明位于页面的左侧，对齐工具位于右侧。仔细按照说明操作是很重要的，因为每一步提示都会有细微的变化。完整的对齐说明不会在这里重复，但这里有一些成功的注意事项:
- 如果其中一个角的形状被薄纸遮住了，最好猜一猜。带有三个角的细粒度对齐仍然会产生令人满意的结果。
- 如果一个角X没有居中，先处理其余的角，然后单击清除中心重置。
-
经过选择和微调后，在图像上方叠加一个红色基准帧，基准标记对齐，如下图所示:
识别组织
选择精确的组织边界可以产生高质量的数据，减少背景驱动聚类的可能性，并为微调测序参数提供准确的spot count。当从识别组织页面开始时，在图像的顶部绘制带有条形码的斑点，这些斑点的位置是从前面的对齐步骤推断出来的，如下图所示。
图像左侧的工具栏提供了各种工具来执行粗粒度（ coarse-grained ）和细粒度（ fine-grained）的组织选择。下表描述了这些工具。
一个典型的组织选择工作流程从套索工具开始。通过在组织周围拖动套索，可以大致选择组织对应的区域。当前选择的斑点比未选择的斑点颜色更深，如下图所示。完成拖动后，将出现一个提示。选定的点可以作为组织标签，标签作为背景，或选择清除选择取消拖动（ Label as Tissue, Label as Background, or Clear Selection）。
以上选择大致对应组织的位置，所以将其标记为组织是合适的选择。标记为组织的斑点显示为绿色，标记为背景的斑点保持为灰色，如下图所示。
通过这种方式，套索工具可以用来创建大面积的组织，大面积的背景区域，或组织中的孔洞。
由于套索工具的近似性质，在组织边界外仍可能有标记为组织的spot。使用缩放(Zoom )工具和更精确的标签作为背景橡皮擦(Eraser )工具来细化边界。放大两个级别，并将橡皮擦大小调整到大约两个点宽，为细化前面的选择提供了良好的控制级别。
标签作为组织刷(Brush )和标签作为背景橡皮擦(Eraser )都有可调的大小，可以通过工具栏下方的滑块进行配置。完成后，缩小应产生一个令人满意的组织边界。
返回到先前的步骤在向导进行微调，作出调整，重新启动对齐，重新启动组织检测，或输入不同的数据。一旦对齐满意，最后一步是将对齐文件导出到Space Ranger。单击“Identify Tissue ”步骤继续。
导出对齐
最后一步，导出到Space Ranger，显示完整的基准点对齐和组织选择，如下图所示。
这幅图像大致反映了在Space Ranger web 摘要中显示的对准预览。单击相机图标将生成一个屏幕截图，用于记录对齐情况。单击Export生成一个JSON文件，如果在输入数据步骤中提供了该文件，则以slide 和捕获区域命名。
该文件在spaceranger管道中用于覆盖自动基准和组织检测。管道操作符需要使用loupe-alignment参数运行管道，并使用生成文件的路径。有关更多信息，请参阅e Space Ranger 文档中的手动对准说明。
$ cd /home/jdoe/runs
$ spaceranger count --id=sample345 \
--transcriptome=/opt/refdata/GRCh38-3.0.0 \
--fastqs=/home/jdoe/runs/HAWT7ADXX/outs/fastq_path \
--sample=mysample \
--image=/home/jdoe/runs/images/sample345.tif \
--slide=V19J01-123 \
--area=A1 \
--loupe-alignment=sample345.json # 我就是 对齐文件
