Bieder A, Einarsdottir E, Matsson H, Nilsson HE, Eisfeldt J, Dragomir A, Paucar M, Granberg T, Li TQ, Lindstrand A, Kere J, Tapia-Páez I. Rare variants in dynein heavy chain genes in two individuals with situs inversus and developmental dyslexia: a case report. BMC Med Genet. 2020. 21(1): 87.
两个患有内脏逆位和发育性诵读困难的个体的动力蛋白重链基因的罕见变异:一个病例报告
摘要
背景：发展性阅读障碍（DD，Developmental dyslexia）是一种遗传度较高的神经发育学习障碍。 一些候选易感基因已经被鉴定，其中一些与纤毛的功能有关，纤毛是调节胚胎中左右不对称发育的细胞器。 此外，有人认为，左右不对称的大脑发育紊乱可能与神经发育障碍有关如 DD 。 但是否有一个共同的遗传原因引起 DD 和侧化缺陷或纤毛病尚不清楚。
案例展示：在这里，我们研究了两个同时发生内脏转位 (SI)和DD的个体，使用全基因组测序来识别对DD和SI重要的遗传变异。个体1有原发性纤毛运动障碍(PCD)，这是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病，具有耳-鼻窦-肺表型和SI。我们在动力蛋白轴突重链5基因(DNAH5)中发现了两个罕见的非同义变异：一个先前报道的变异c.7502G >C；p.(R2501P)和一个新的变异c.12043 T>G; p.(Y4015D)。预计这两种变异都具有破坏性。纤毛的超微结构分析显示外动力臂缺乏，内动力臂正常。脑部核磁共振没有发现明显的异常。个体2有非综合征SI和DD。在个体2中，在动力蛋白轴突重链11基因(DNAH11)中发现了一个罕见的变异(c.9110A > G;p.(H3037R)) ，编码了外动力蛋白臂的另一个组成部分。
结论：我们在一个个体中确定了SI和PCD可能的遗传原因，在另一个个体中确定了可能的显著杂合度，两者都涉及到动力蛋白基因。鉴于目前的证据，尚不清楚所识别的变异是否也容易导致DD，还需要进一步研究侧性、纤毛病和DD之间的关系。
1. 背景
左右不对称状态的特征是器官沿左右轴的组织衰竭[1]。偏侧性是通过胚胎节点处的活动纤毛和初生纤毛形成的。在人类身上已经发现了一些在被破坏时引起侧性紊乱的基因[1]。大约20-25%的内脏器官的完全反位（SI），个体可也受到原发性纤毛运动障碍（PCD）的影响[1]。PCD（OMIM#244400）是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病，由活动纤毛的功能损害引起。PCD可导致耳-肺疾病，约50%的病例伴有典型的三联慢性鼻窦炎、支气管扩张和SI（Kartagener综合征）。PCD具有异质性的遗传基础，迄今已有40多个基因突变被认为是病因，其中动力蛋白-轴丝重链5基因DNAH5占病例的最大比例（28%）[2,3,4]。
发展性阅读障碍（DD）是最常见的神经发育障碍之一，约影响5-12%的人口，是高度遗传的[5]。DD的潜在神经发育原因尚不完全清楚。一种假设是，发育过程中的神经元迁移障碍导致成年大脑神经元错位，导致白质和灰质改变[5]。早期的研究表明大脑不对称的作用，例如颞平面[6]。
DD的遗传学研究已经导致了一些阅读障碍易感基因的鉴定，在[7]中进行了综述。 有趣的是，其中一些基因，即DYX1C1(DNAAF4)，DCDC2和KIAA0319，据报道在纤毛中有作用[8，9，10，11，12，13，14]。 此外，在表现出典型纤毛缺陷的患者中还发现了DYX1C1和DCDC2功能丧失突变：PCD患者中存在DYX1C1[15]，肾炎相关纤毛疾病患者中存在DYX1C1，遗传性耳聋和新生儿硬化性胆管炎患者中存在DCDC2[16，17，18，19]。 其他阅读障碍候选基因，如CEP63和PCNT涉及中心体和基底生物体[20，21]。
虽然DD与大脑的各种解剖和功能变化有关[22]，但一些报告已经研究了内脏反位患者的大脑解剖和功能(例如[23，24，25，26，27])。 有趣的是，一系列神经发育障碍，如自闭症、精神分裂症和痴呆症，都与大脑的偏侧缺陷有关[28]。 关于纤毛基因和DD的最新发现为DD中的脑不对称理论和神经元纤毛信号理论提供了新的视角[14]。 目前尚不清楚纤毛表型和DD是否有共同的遗传原因。
在这里，我们试图解决SI和DD潜在的共同遗传原因。我们研究了两个SI和/或PCD和DD个体，使用全基因组测序（WGS）来确定其表型的可能遗传原因。此外，我们对其中一个人进行了脑部成像，以确定大脑中与SI或DD相关的潜在变化。
2. 案例展示
2.1 案例1
1号个体是一名瑞典妇女，患有PCD和DD，出生于非近亲父母。她出现了以下PCD症状：支气管扩张、内脏转位（图1A）和自出生以来反复出现的上下呼吸道感染。鼻腔上皮刷状活检的透射电镜结果（见附加文件1，方法）包括杯状细胞增生、纤毛细胞数量减少、微绒毛和散在分布的淋巴细胞数量增加（图1b）。PCD的特征是缺乏外动力蛋白臂（ODA）（平均每纤毛2.4+/- 0.2；正常值：7-9 ODA/纤毛）。内动力蛋白臂（IDA）的数量在正常范围内（平均值4.05±0.2；正常值：2-7）（图1c）。其他诊断包括左凸性脊柱侧凸（图1A）、注意缺陷多动障碍（ADHD）和阿斯伯格综合征。值得注意的是，这个人是左撇子（爱丁堡库存偏侧指数-60.00），并且有镜像写作的能力，这一现象在阅读障碍和左撇子身上的比例很高[29]。神经系统检查正常，家族中没有PCD病史（图1d）。父亲自报患有DD，一个侄女被正式诊断患有DD（图1d）。有关临床表型的概述，请参见表1。
从唾液中分离出DNA样品，并在一个Illumina HiSeqX泳道上进行了测序，平均测序深度为32x（请参见附加文件1，方法）。 由于个体中存在PCD，DD和脊柱侧弯的表型三联征，因此分析首先集中于DYX1C1，该疾病先前与DD相关，在突变时会引起PCD，而缺乏dyx1c1直向同源物会导致斑马鱼的脊柱弯曲[15]。 ，30，31]。 在DYX1C1中未找到先前与PCD或DD相关的SNV，也未发现任何其他罕见的编码或非编码变异。
对于下游分析，我们提取了所有的编码突变和规范剪接突变，排除了所有同义变体，进一步考虑了插入、删除、stop-gain, stop-loss和非同义变体。 在1000G (全部)、1000G (欧洲)、 ExAC (全部)和 ExAC (非芬兰欧洲)数据库中，只保留了1% 的等位基因频率变异。我们关注的是一组已知会导致偏侧性缺陷的 PCD 基因(n=33)[2,4,32](附加文件1，表 S1)。由于 PCD 主要以常染色体隐性遗传方式遗传，我们假设为纯合性或复合杂合性。因此，双等位基因变异被优先考虑。 我们在 DNAH5中发现了2个非同义变体，这些变体已被桑格测序基因组学证实（图1e和f），突变c.7502G > C;p.(R2501P) (rs78853309; NC_000005.9:g.13810275C > G; NM_001369.2:c.7502G > C)在 exon 45中的频率为4*10^(-4)在 ExAC 中，1.8*10^(-4)在 GnomAD 中，1000G 和 SweGen 数据库中没有报告。 它被预测为高度保守(GERP 5.31)，所有评估预测工具(SIFT，Polyphen2，变异 taster，CADD 和 GERP + +) 显示为有害，包括 CADD 得分26.8。 同样的变异以前在两个PCD 复合杂合子患者中被报道过[3,33]。 它被列在 ClinVar (ID: 179699)中，并被描述为可能具有破坏性。 根据 ACMG-AMP 突变分类标准[34]将其归类为不确定意义变异(VUS)。 第二个突变为 c.12043 T > G;p.(Y4015D) (rs754466516; NC_000005.9:g.13721345 T > G; NM_001369.2:c.12043 T > G) 在 exon 71中，在 ExAC 中的频率为1.65*10^(-5)，在 GnomAD 中的频率为0.81*10^(-5)，在1000G 和 SweGen 数据库中没有报告。 它是保守的(GERP 5.4) ，并被所有评估预测工具预测为有害，包括 CADD 得分26.5。 它以前没有与 PCD关联在一起。 在 GnomAD 中，没有观察到这两种报告的变异处于纯合状态。 亲代 DNA 不可用于分析，因此这些突变在一个未受影响的兄弟姐妹中分析。未受影响的同胞c.7502G > C呈杂合子型，而c.12043 T > G呈野生型(图1 d) ，表明受影响个体为 DNAH5变异体的复合杂合子型。 为了检测 DNAH5稀有变异是否与 DD 共同分离，我们对个体的两个侄女进行了桑格测序检测，其中一个受到影响，另一个未受 DD 影响。它们中没有一个携带 DNAH5中的任何两个变体(图1 d)。 (更多深入的序列分析，请参阅附加文件1，补充结果.)
进行MRI脑部扫描以探讨存在反位和DD的神经解剖结构和功能（请参见附加文件1，方法）。 放射学评估未发现个体1的任何结构解剖异常。个体1和健康对照的3D T1加权图像显示在附加文件1中，图S1。 fMRI与无声单词生成任务结合使用来评估半球偏侧性（图2a，b）。 我们在对照组中观察到额叶回的双边激活，这在个体1中是不存在的。有趣的是，个体1中顶叶的额外激活。总的来说，这些数据不能得出关于个体半球侧向性的结论。 将皮质脊髓束的弥散张量成像（DTI）图像与年龄和性别相匹配的右手对照对象进行比较。 在个体1中，我们观察到右侧的DTI道比左侧的多，相对于对照而言，这是相反的。 另外，与对照相比，我们观察到个体1中穿过胼胝体的皮质脊髓束更少（图2c，d）。 总的来说，DTI数据表明个体的右半球活动占主导可能与左撇子有关。
总之，我们确定了DNAH5中先前已知和一个新发现的突变，可能是该个体PCD的原因。
2.2 案例2
个人2是一名美国高加索男孩，患有非综合征SI和DD(GORT-5)总阅读指数=84。 他有轻微的下胸椎向左弯曲，但没有PCD的症状，纤毛活检没有定论(数据未显示)。 他的父亲有自我报告的DD，但没有被正式诊断(图3a)。 这位母亲有轻微的脊柱侧凸。 无SI或PCD家族史。 该个体还表现出ADHD的症状。 有关个体表型的概述，请参见表1。
从唾液样品中提取DNA，然后在Illumina HiSeqX上以25x的平均测序深度运行WGS（请参见附加文件1，方法）。 首先，我们检查了DYX1C1基因，发现以前与阅读障碍有关的常见单倍型 -3G > A/1249G > T (rs3743205; rs57809907)[30]。 但是，单倍型不能与阅读障碍表型共分离。如桑格测序所示，它也存在于母亲和兄弟姐妹中（数据未显示）。 我们没有找到以前与PCD或DD相关的任何其他SNV，也没有在DYX1C1中找到任何其他稀有变体。
与个体1中一样，我们提取了编码和规范剪接突变，排除了所有同义变体，并进一步考虑了插入、删除、 stop-gain, stop-loss和非同义变体。 剩余的变异被频率 MAF 1% 过滤(见上文) ，并与偏侧性缺陷相关的基因列表进行比较(附加文件1，表 S1)。 个体2为单个罕见变异体c.9110A > G;p.(H3037R) (rs192327380; NC_000007.13:g.21813391A > G; NM_001277115.2:c.9110A > G)在 DNAH11第56外显子，我们用桑格测序证实了该突变。 突变的频率在 ExAc 中为1.5*10^(-3)，在1000G中为0.8*10^(-3)，在 GnomAD 中为7.8*10^(-4)。 靶向桑格测序显示这种变异是从母体遗传的。 所有评估的预测工具，包括 CADD 得分8.4，都预测该变异是良性的。 然后我们将搜索范围扩大到 DNAH11中更常见的 SNVs (MAF < 50%) ，但是没有发现一个是从父亲那里遗传来的。
未发现导致L/R不对称缺陷(n = 39)[1]基因的致病变异(附加文件1，表S1)。(有关更深入的序列分析，请参阅附加文件1，补充结果)
综上所述，在个体2中，我们发现了一种常见的与dd相关的单倍型和一种罕见的未知重要性的变异，其外动力蛋白臂成分DNAH11均遗传自母亲。
3. 讨论和结论
一些报道表明 DD 候选基因在纤毛中发挥作用[8,9,12,13,15,16,17,18,19]。 此外，大脑 l / r 不对称性缺陷被认为是精神分裂症等神经发育障碍的解剖学基础，特别是 DD，可能是由纤毛功能障碍介导的[14,28]。 在这里，我们研究了两个个体 DD 和 SI 和 / 或 PCD 的潜在遗传原因。 据我们所知，这是第一个专门针对 DD 与已知纤毛病共同发生的遗传学研究。
在个体1中，我们在DNAH5中发现了一个新的(c.7502G > C; p.(R2501P)) 和一个先前报道的稀有突变(c.12043 T > G;p.(Y4015D)) 。这两种变异都被认为是又害的，在另外至少两名PCD患者中观察到了 c.7502G > C[3，33]。我们假设个体1可能是复合杂合子，因为重组事件或从头事件的可能性非常低。DNAH5基因编码一种外臂轴丝体动力蛋白重链蛋白[3]。DNAH5突变导致ODA缺陷，但不影响IDAs，这与个体中发现的纤毛超微结构一致。DNAH5在发育中的人脑中的表达相当低，如艾伦脑图谱所述，在初级纤毛/神经纤毛中没有已知的功能（http://www.brainspan.org/）[35]。可能DNAH5通过胚胎节点的纤毛左右模式，导致大脑异常不对称。大脑的不对称性可能反过来导致DD。然而，在个体1家系中的遗传共分离模式显示DD不与DNAH5中的变体共分离。另一种可能解释为DD遗传模式可以由另一个基因中一个罕见变异的常染色体显性遗传模式（在个体的兄弟姐妹中具有不完全外显）或由具有几个低外显共同变异的复杂遗传模式来解释。所有家族成员的WGS可能阐明DD的遗传模式，尽管家族的小规模使无候选方法WGS分析复杂化。
Dti 纤维束成像结果显示大脑半球优势反转，而 fMRI 语言优势测试结果不确定。 在诵读困难症患者中，已经报道了大脑的异常对称性——既增加了不对称性，也减少了不对称性。 然而一些研究报告一个典型的左半球语言偏侧化在 SI 大脑，其他报告的语言中心的逆转到对面的半球[23,24,25,26,27]。 虽然用手习惯和半球语言优势之间有着强有力的联系，但是内脏坐位和半球优势之间的关系更加复杂，这表明大脑不对称性的发展独立于身体中主要的对称性破坏途径[26,37,38]。 所观察到的皮质脊髓纤维束逆转可能与个体的左利手性有关。
综上所述，我们确定了DNAH5中一个先前已知的和新的变异，作为个体1的PCD的可能原因。
在个体2中，我们鉴定了一个先前与DD相关的单倍型。 然而，单倍型并不与阅读障碍表型共分离。 在仔细检查PCD和L/R不对称基因后，在DNAH11中发现了一个罕见的变异。DNAH11突变的 PCD 患者纤毛的超微结构正常与本例一致，临床报告纤毛活检无定论。 缺乏第二个突变并不排除DNAH11作为候选，因为可能存在另一个尚未识别的遗传突变。 然而，该变异被预测为良性的，在13例没有PCD的孤立内翻位中没有发现DNAH11突变[39]。 此外，还观察到GnomAD数据库中DNAH11中的变异体 c.9110A > G 在一个个体中处于纯合子状态。总体而言，这一证据削弱了DNAH11作为该个体候选基因的实力。 应该注意的是，多基因遗传和环境因素被认为在偏侧障碍中起作用，这可能解释了在个体2[1]中寻找致病变异的困难。 总而言之，我们认为这个病例没有解决，因为观察到大约50%没有PCD的SI病例在全基因组测序后仍然没有解决[40]。
综上所述，我们报道了 DNAH5中一个已知的和新的变异可能引起 PCD 的遗传变异，这将对 PCD 的诊断有价值。 我们认为，报告的变异正在增加 VUSs 的分类。 然而，他们在 DD 病理学的参与仍然难以捉摸。关于 DD 表型，这些变异的可能作用不能排除，但仍有待确定。未来的功能研究应该特别测试这些变异是否具有功能性后果，并且旨在阐明纤毛基因在大脑中的一般作用。 我们建议在动力蛋白 / 纤毛基因中研究 DD。
需要掌握的技能：
1. 在各个数据库中寻找突变频率，在GenomAD数据库中寻找纯合子。
审稿意见：在第二个患者中，p.His3037Arg在gnomAD中出现了200次，在阿什肯纳希族犹太人（Ashkenazi Jewish）个体中频率为85/4644(AF=85/9288)，作为gnomAD v2.1.1.1的一部分：https://gnomad.broadinstitute.org/variant/7-21813391-A-G?dataset=gnomad_r2_1(突变也叫p.His3044Arg)，作者指出，在数据库中也可以看到纯合子。在ClinVar中也被注解为可能是良性的：www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/variation/238941/evidence/。虽然作者对这个变异体的解释适当且谨慎，但这让我想知道，鉴于他们有WGS的数据，并且已经在突变中仔细寻找过，添加这个第二个case的价值是什么？
答复：我们同意审查员的意见，即病例2的证据不足。我们确实同意审稿人的观点，认为病例2的证据不足。我们决定将病例2纳入报告中，以避免 "文件抽屉 "效应（Song F, Hooper L, Loke Y. Open Access Journal of Clinical Trials. 2013;5:71-81 https://doi.org/10.2147/OAJCT.S34419) 事实上，尽管进行了全基因组测序，但许多罕见病病例仍然没有得到分子诊断(http://solve-rd.eu/)，估计有50%没有PCD的SI病例仍然没有得到分子诊断(Postema等，2020，PMID 32111882)。请注意，我们在第273-276行讨论了这一点，指出多基因和环境因素也会对内脏转位产生影响。我们在该段中增加了一个句子以澄清（第276-278行）。
2. 查找ACMG-AMP 相关的资料。
The American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG)/Association for Molecular Pathology (AMP)
