Cell | 刘如谦改进基因编辑系统，效率提高数倍

原创 风不止步 图灵基因 今天

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撰文：风不止步

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PE4和PE5引物编辑系统，其中与PE2和PE3系统相比，工程化MMR抑制蛋白的瞬时表达分别将替换、插入和缺失引物编辑的效率提高7.7倍和2.0倍左右，同时在MMR熟练的细胞类型中将编辑/插入删除比率提高3.4倍。这些发现丰富了对主要编辑的理解，并建立主要编辑系统，该系统在七种哺乳动物细胞类型的191次编辑中显示出实质性改进。

2021年10月4日，哈佛大学的刘如谦（David R. Liu）教授等人在《Cell》上发表了一篇“Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes”的文章。

以可编程的方式操纵基因组的能力已经照亮生物学，并在遗传疾病的临床治疗中显示出前景。为实现广泛的序列变化的目标，开发一种通用的基因编辑方法prime editing，可安装所有类型的目标DNA碱基对替换、小插入、小删除以及它们的组合，而不需要双链DNA断裂（DSBs）或供体DNA模板。主体编辑已被广泛用于在苍蝇、水稻和小麦、斑马鱼、小鼠胚胎、产后小鼠、人类干细胞和病人衍生的器官中引入基因变化。尽管它具有多功能性，但质粒编辑的效率在不同的编辑类别、目标位点和细胞类型中差异很大。为最大限度地发挥质粒编辑的效用，试图确定质粒编辑结果的细胞决定因素，并利用由此产生的洞察力来开发改进的质粒编辑系统。

主体编辑只需要两个组件：一个融合Cas9缺口酶的工程逆转录酶（RT）（PE2蛋白）和一个主体编辑指导RNA（pegRNA），其中包含一个与目标DNA互补的间隔序列和一个编码所需编辑的30延伸序列（图1）。PE2-pegRNA复合物与目标DNA位点的一条链结合，并咬断相反的链，暴露DNA，与pegRNA延伸部分的引物结合点（PBS）杂交。在pegRNA延伸部分内的RT模板反转录，然后产生一个包含编辑序列的30号DNA瓣，并最终导致该序列被纳入基因组中。PE3系统与PE2不同，它使用一个额外的单向导RNA（sgRNA）在远离pegRNA靶点的位置截断非编辑链，提高编辑效率。然而，钉住非编辑链也增加靶点上不希望出现的插入和缺失（indels）的频率。

体外实验为初级编辑的早期步骤提供支持，但30瓣合成的下游机制仍然是推测性的。根据目前的模型，新合成的30瓣通过瓣的相互转换取代相邻的基因组DNA链。然后切除移位的50瓣，允许将编辑过的序列连接到基因组中。在PE3系统中钉住非编辑链被认为是诱发非编辑链的细胞替换，从而促进了编辑序列在两条链上的安装。

推测细胞因素参与这些步骤，促使研究DNA修复机制在质粒编辑中的作用，并通过操纵这些过程来开发改进的质粒编辑系统。使用基于CRISPR干扰（CRISPRi）的集合筛选，系统地探测参与DNA修复和相关过程的476个基因对替换原点编辑结果的影响。发现了特定的DNA错配修复（MMR）基因较强抑制质粒编辑的效率，并促进缩减的形成。与MMR逆转在质粒编辑过程中形成的异质双链DNA的模型相一致，确定了不太容易受到MMR活动影响的质粒编辑类别，因此产生的效率更高。综合这些发现，通过瞬时表达显性阴性的MMR蛋白（MLH1dn）开发改进主编辑系统。在六种MMR适配的细胞类型中，包括诱导多能干细胞（iPSCs）和初级T细胞，这些PE4（PE2+MLH1dn）和PE5（PE3+MLH1dn）系统比PE2和PE3的编辑效率分别平均提高了7.7倍和2.0倍，并将编辑/印迹比率（结果纯度）提高了3.4倍。MLH1dn的暂时共表达并没有导致微卫星重复长度的变化，微卫星重复长度是MMR熟练程度的一个临床生物标志。即使在没有MLH1dn的情况下，在预期的编辑附近战略性地安装额外的沉默突变也可以通过逃避MMR的识别来提高主要编辑效率。最后设计一个优化的 "PEmax"主编辑架构，在与PE4、PE5和工程pegRNAs（epegRNAs）的协同作用下进一步提高编辑效率。这些发现加深对质粒编辑的理解，建立质粒编辑系统，在7种哺乳动物细胞类型的20个基因座的191个不同的编辑中，效率和结果的纯度都得到了大幅提高。

通过使用汇集的CRISPRi屏幕发现MMR活性强烈地抑制替换原位编辑的效率和结果的纯度。这些见解为开发PE4和PE5系统提供依据，这两个系统共同表达MLH1dn，以暂时抑制MMR，提高质粒编辑效率，并在不诱发大量非目标基因组变化的情况下减少印记。首要编辑蛋白的优化产生一个PEmax架构，可与PE4和PE5系统以及epegRNAs协同作用，进一步提高首要编辑性能。这些发现所支持的质粒编辑的DNA修复模型、为规避质粒编辑瓶颈而开发的PE4和PE5策略，以及改进的PEmax质粒编辑架构，共同推进质粒编辑在基因组精确操作方面的效用。

PE4和PE5在191种不同的质粒编辑中的广泛特征显示，由于相应的质粒编辑中间物具有逃避MMR的能力，质粒编辑可以以更高的效率安装某些类型的编辑。除编辑类型外，其他属性也可能影响编辑对MMR的敏感性，如目标位点的序列环境。此外，MMR在复制过程中更有效地修复早期复制的异染色质和滞后链DNA。需要对更大范围的编辑进行系统研究，以全面阐明这些编辑类型、序列背景和基因座状态对MMR和主要编辑的依赖性。未来还可以应用修复基因组学来阐明其他类别的质体编辑，如长插入或删除，并提出更多改进的质体编辑系统。

对被MMR修复的质粒编辑中间产物类型的研究，使研究人员能够设计质粒编辑实验来规避MMR，即使没有MLH1dn的表达。表明在附近安装额外的沉默突变，可通过避免MMR逆转主要编辑中间产物来提高主要编辑结果。抑制MMR的其他方式也可能被证明对初级编辑有益。虽然还没有报道过选择性靶向MMR的小分子，但化学抑制剂在受限于MLH1dn传递的应用中会很有用。对于维持长期编辑表达的病毒传递等用途，RNA干扰提供一种替代手段来暂时击倒MMR活性。

PE4和PE5系统在测试的七种哺乳动物细胞类型中提高主编辑的性能和精度，并与PEmax和epegRNAs的改进协同作用。PE4max与epegRNAs独特地实现高效的质粒编辑，且副产物较少，尤其是在具有活性MMR的细胞中，使其最适合于需要高结果纯度或不能使用nicking sgRNA的基因编辑应用。相比之下，与PE3系统相比，使用epegRNAs的PE5max实现最高水平的质粒编辑，并减少缩减结果。因此，推荐使用PE5max和epegRNAs来进行大多数质粒编辑应用。

教授介绍

刘如谦（David R. Liu） 是 Richard Merkin 教授、Merkin 医疗保健变革技术研究所所长，以及哈佛大学和麻省理工学院 Broad 研究所的副主席；哈佛大学 Thomas DudleyCabot 自然科学教授、化学与化学生物学教授；霍华德休斯医学研究所研究员。

于 2003 年晋升为副教授，2005 年晋升为正教授。于 2005 年成为霍华德休斯医学研究所研究员，并于 2009 年加入美国政府学术科学顾问 JASON，目前在哈佛任教。

已发表超过 180 篇论文，是超过70项已授权美国专利的发明者。他的研究荣誉包括Ronald Breslow仿生化学奖、美国化学学会纯化学奖、Arthur C. Cope青年学者奖，以及斯隆基金会、贝克曼基金会、NSF CAREER计划和Searle学者计划的奖项。2016年，他被NatureBiotechnology评为全球前20名转化研究人员之一。2017 年，被评为Nature全球 10 位研究人员和外交政策领先的全球思想家。

刘教授的研究将化学和进化结合起来，以阐明生物学并实现下一代疗法。主要研究兴趣包括基因组编辑蛋白（如碱基编辑器和引物编辑器）的工程、进化和体内传递，以研究和治疗遗传疾病；使用噬菌体辅助连续进化 (PACE) 进化具有新治疗潜力的蛋白质；以及使用 DNA 模板有机合成和DNA编码文库发现生物活性合成小分子和合成聚合物。基础编辑（被《科学》杂志评为2017年度最佳突破奖入围者之一)、引物编辑、PACE 和DNA 模板化合成是他实验室首创的四个技术示例。他还是七家生物技术和治疗公司的科学创始人或联合创始人，包括 Editas Medicine、Pairwise Plants、Exo Therapeutics、Beam Therapeutics 和 Prime Medicine。

参考文献

 Peter J. Chen,Jeffrey A. Hussmann etal.Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants ofediting outcomes.(2021)