01一、文章信息
发表杂志名称：Cancer Cell
中文标题：鉴定胶质母细胞瘤中具有血管正常化治疗潜力的乏氧巨噬细胞
英文标题：Identification of hypoxic macrophages in glioblastoma with therapeutic potential for vasculature normalization
影响因子：44.5
发表日期：2024 年 5 月 13 日
01二、研究概述
作者针对 51 例弥漫性胶质瘤患者（含 40 例 IDH 野生型胶质母细胞瘤、8 例 IDH 突变型星形细胞瘤、3 例 IDH 突变型少突胶质细胞瘤）及 12 例小鼠胶质母细胞瘤样本展开研究，运用单细胞转录组学、空间转录组学等技术，解析单核细胞来源肿瘤相关巨噬细胞（Mo-TAMs）的异质性。研究鉴定出 6 个功能与空间离散的 Mo-TAM 亚群，重点聚焦乏氧巨噬细胞（Hypoxia-TAM），发现其受肿瘤坏死区乏氧微环境诱导，通过分泌肾上腺髓质素（ADM）破坏血管内皮黏附连接，导致肿瘤血管高通透性。进一步实验证实，基因敲除 ADM 或使用 ADM 拮抗剂（AMA）可恢复血管完整性，提升抗瘤药物（如达拉菲尼）在肿瘤内的浓度，延长荷瘤小鼠生存期，且 Hypoxia-TAM 比例或 ADM 高表达与胶质母细胞瘤患者不良预后相关，为胶质母细胞瘤治疗提供新靶点与策略。
（一）图 1：人弥漫性胶质瘤中 Mo-TAMs 的单细胞图谱
作者获取 51 例人弥漫性胶质瘤及 12 例小鼠胶质母细胞瘤样本的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据，对髓系细胞组成及 Mo-TAM 异质性进行分析，肿瘤样本涵盖不同类型且部分位于大脑不同脑叶。通过无偏聚类和细胞谱系注释，作者识别出 360214 个单细胞，分为 12 个主要谱系，其中肿瘤细胞和髓系细胞为最丰富类型，髓系细胞进一步聚类为单核细胞、Mo-TAMs 等 5 类，且发现 IDH 野生型胶质母细胞瘤中 Mo-TAM 比例高于 IDH 突变型胶质瘤。作者还剖析人 Mo-TAMs，鉴定出 6 个具有独特分子特征的聚类，如 Hypoxia-TAM 高表达缺氧响应基因，Chemo-TAM 富集趋化相关基因等。通过荟萃分析，作者证实 Mo-TAM 聚类在人和小鼠中保守，但不同类型人弥漫性胶质瘤中 Mo-TAMs 组成有差异，且部分亚群在其他实体瘤中也存在保守性。本图清晰呈现了人弥漫性胶质瘤中 Mo-TAMs 的单细胞景观，揭示其异质性、保守性及分布差异。
（二）图 2：Mo-TAM 分类方案的临床相关性
作者利用癌症基因组图谱（TCGA）- 胶质母细胞瘤 / 低级别胶质瘤 RNA 测序数据集，通过解卷积分析估算各 Mo-TAM 聚类的频率。研究发现，IDH 野生型胶质母细胞瘤中 Hypoxia-TAM、Chemo-TAM、IFN-TAM 和 Lipid-TAM 的频率升高，而 Ribo-TAM 和 Phago/AP-TAM 的频率降低，且不同 Mo-TAM 聚类的比例与胶质瘤分级及关键分子变化相关。尤为重要的是，多因素 Cox 回归分析显示，在胶质母细胞瘤患者中，Hypoxia-TAM 的估算比例可独立预示不良预后，提示其具有肿瘤支持功能。本图通过临床数据集分析，证实了 Mo-TAM 分类方案在评估弥漫性胶质瘤 Mo-TAM 组成方面的可行性、可重复性及临床意义，为通过 Mo-TAM 组成判断患者预后提供依据。
（三）图 3：空间分辨率下 Mo-TAMs 的细胞多样性
作者利用 Ivy - 人胶质母细胞瘤队列，将 Mo-TAMs 的转录特征与人类胶质母细胞瘤组织的不同组织学区域相关联，估算各 Mo-TAM 聚类的比例，发现 Hypoxia-TAM 优先定位于坏死周围区域，其他亚群在不同区域分布有差异。作者重新分析公共空间转录组数据集，发现空间分辨转录组谱再现了不同 Mo-TAM 聚类的预测空间分布。此外，作者绘制人胶质母细胞瘤组织中的缺氧空间梯度，发现随着缺氧梯度增加，Hypoxia-TAM 比例上调，且缺氧水平与肿瘤细胞状态、细胞功能及免疫活性相关。对 Hypoxia-TAM 空间特征的专项分析显示，其转录特征和 ADM 表达在缺氧肿瘤区域显著上调，共染色证实其与坏死区域邻近，且特征基因在胶质母细胞瘤中高表达。本图明确了不同 Mo-TAM 亚群在人类胶质母细胞瘤组织中的空间分布特征，及缺氧梯度与 Mo-TAM 组成等的关联。
（四）图 4：乏氧肿瘤信号促进 Hypoxia-TAM 极化
作者建立体外 Mo-TAM 极化模型，将不同来源的 Mo-TAMs 置于肿瘤细胞条件培养基（TCM）加 1% O₂的培养条件下，发现该条件能有效上调 Hypoxia-TAM 特征基因的表达。作者对巨噬细胞进行 bulk RNA-seq 分析，显示暴露于 TCM 加 1% O₂的巨噬细胞与 Hypoxia-TAM 转录特征相似。通过蛋白质组学和代谢组学分析，作者鉴定出肿瘤细胞衍生的 SPARC 和缺氧诱导的乳酸是诱导 Hypoxia-TAM 特征的关键微环境因子。作者还筛选缺氧相关基因并绘制相互作用网络，发现核心转录因子和缺氧响应基因在 Hypoxia-TAM 中富集。通过基因富集分析和转录因子筛选，作者确定 p50 是 Hypoxia-TAM 特征形成的关键转录因子，且肿瘤细胞产生的 SPARC 和缺氧诱导的乳酸通过激活 p50 促进 Hypoxia-TAM 极化。本图阐明了乏氧肿瘤信号诱导 Hypoxia-TAM 极化的机制及关键调控因子。
（五）图 5：Adm 敲除恢复小鼠胶质母细胞瘤异种移植瘤血管完整性
作者构建 Adm 条件敲除小鼠（Adm cKO mice），通过将 GL261 小鼠胶质母细胞瘤细胞植入小鼠体内建立异种移植模型。作者采用活体成像技术观察肿瘤血管，发现 Adm cKO 小鼠异种移植瘤中肿瘤血管数量和连接点密度适度降低，内皮细胞间间隙显著缩小。免疫染色结果显示，Adm 敲除使内皮黏附连接标志物 VE - 钙黏蛋白表达大幅恢复，而紧密连接标志物、周细胞标志物和血管基底膜标志物表达未受影响。作者通过血管通透性评估发现，Adm cKO 小鼠异种移植瘤中尸胺渗漏区域大幅减少，且 Adm 敲除对小鼠正常脑血管的完整性和通透性无影响。本图证实 Adm 敲除可选择性恢复胶质母细胞瘤异种移植瘤血管的完整性，降低血管渗漏。
（六）图 6：ADM 通过激活 CRLR 信号破坏内皮黏附连接
作者对比 Adm cKO 和野生型小鼠异种移植瘤内皮细胞，发现 Adm cKO 组内皮细胞中黏附连接通路富集且 VE - 钙黏蛋白编码基因 Cdh5 表达增加。用重组人 ADM（rhADM）处理人脑微血管内皮细胞（HBMECs），作者观察到细胞膜上的 VE - 钙黏蛋白转移到细胞质中。当 HBMECs 接受 U937 来源 Hypoxia-TAM 的条件培养基（TAM-CM）处理时，内皮连接明显分离且 VE - 钙黏蛋白内化，而 ADM 拮抗剂（AMA）处理可大幅逆转这些现象，同时减少血管渗漏。通过 CellphoneDB 分析，作者发现 Hypoxia-TAM 与内皮细胞间 ADM-CRLR 相互作用增强，免疫染色证实 CRLR 与内皮细胞标志物 CD31 在人胶质母细胞瘤坏死周围区域共定位且 ADM 信号上调。沉默 CRLR 表达可大幅削弱 ADM 诱导的 VE - 钙黏蛋白内化和血管渗漏，且 ADM 通过激活 CRLR 信号，促进 Src 和 VE - 钙黏蛋白磷酸化，进而导致 VE - 钙黏蛋白内化。本图揭示了 ADM 通过激活 CRLR 信号破坏血管内皮黏附连接的分子机制。
（七）图 7：AMA 处理使人类胶质母细胞瘤异种移植瘤血管正常化
作者在人 GBM-3 异种移植模型中（联合植入 U937 来源 TAMs）使用 AMA 处理，该模型成功模拟了人胶质母细胞瘤缺氧微环境的特征。免疫染色结果显示，AMA 处理恢复了 VE - 钙黏蛋白的表达，维持了内皮连接的完整性，减少了尸胺渗漏，且对小鼠正常脑血管无明显影响。作者进一步检测肿瘤缺氧状态和药物递送情况，发现 AMA 处理使 pimonidazole 标记的缺氧区域大幅减少，阿霉素灌注区域显著增加。磁共振成像结果证实，接受 AMA 处理的 GL261 小鼠胶质母细胞瘤异种移植瘤中血流灌注增加。此外，作者发现 ADM 刺激不影响人 GBM-3 细胞活力，且在未植入 U937 来源 TAMs 的对照模型中，AMA 对 VE - 钙黏蛋白表达和尸胺渗漏影响极小，也不改变缺氧区域和药物灌注区域比例。本图证实 AMA 可通过靶向 TAM 分泌的 ADM，实现人类胶质母细胞瘤异种移植瘤血管的正常化，改善肿瘤微环境和药物递送。
（八）图 8：AMA 改善达拉菲尼递送及治疗效果
作者观察到 BRAF V600E 突变型人胶质母细胞瘤具有明显坏死、VE - 钙黏蛋白缺乏的丰富血管及大量产生 ADM 的 TAMs。在携带 BRAF V600E 突变型人 GBM-4 异种移植瘤的小鼠中，作者设置 vehicle 对照、AMA、达拉菲尼、AMA 联合达拉菲尼四组治疗方案。结果显示，AMA 与达拉菲尼联合治疗显著延长了小鼠生存期，减少了肿瘤负荷。免疫染色和检测表明，AMA 处理提高了 VE - 钙黏蛋白阳性血管的比例，减少了尸胺渗漏，显著增加了肿瘤内达拉菲尼的浓度。此外，联合治疗组中磷酸化 ERK 阳性细胞比例大幅降低，TUNEL 阳性凋亡细胞比例显著增加，表明肿瘤细胞增殖受抑、凋亡增强。本图证实 AMA 可通过改善肿瘤血管功能，提升抗瘤药物达拉菲尼在肿瘤内的递送效率，与达拉菲尼产生协同治疗效果，为胶质母细胞瘤的联合治疗提供实验依据。
作者通过对 51 例弥漫性胶质瘤患者及 12 例小鼠胶质母细胞瘤样本的研究，运用单细胞转录组学、空间转录组学等多组学技术，鉴定出 6 个功能与空间离散的单核细胞来源肿瘤相关巨噬细胞（Mo-TAMs）亚群，重点揭示了乏氧巨噬细胞（Hypoxia-TAM）的特征与作用 —— 其受肿瘤坏死区乏氧微环境诱导，通过分泌肾上腺髓质素（ADM）激活内皮细胞 CRLR 信号，破坏 VE - 钙黏蛋白介导的黏附连接，导致肿瘤血管高通透性；进一步通过基因敲除 ADM 或使用 ADM 拮抗剂（AMA），可恢复肿瘤血管完整性，改善抗瘤药物（如达拉菲尼）的递送效率，延长荷瘤小鼠生存期，且 Hypoxia-TAM 比例或 ADM 高表达与胶质母细胞瘤患者不良预后相关，该研究为胶质母细胞瘤的血管正常化治疗及靶向 Mo-TAM 的精准治疗提供了新的靶点、机制与策略。
