RT-PCR:实验方法技巧

定量pcr有两种：

荧光，通过染料里的荧光，随着pcr产物的增多，而出现光信号的差异。通过激发光的差异，来分析每个孔的样品的产物的量的差异。
代表染料：Takara RR820A/B
说明书下载地址密码：hdum
2.探针法：
代表染料：百泰克的染料
我们一般使用的是Takara的染料。10ul体系。
每孔体系如下：
引物F 0.3ul
引物R 0.3ul
2*TBGreenBuffer II 5ul
稀释10x后的cdna 2ul
RNase ddH2O 2.4ul
建议是配成大体系后，每孔10ul.总体系，每10个孔多配一个孔。否则最后体系会不够用。
经验：引物的用量可以减少到0.2ul
个人经验：配置好样品后，在4度冰箱放置0.5-2h，之后的峰图会更加稳定可重复性会更好。
定量pcr仪是：伯乐的CFX96
定量软件：Bio-rad CFX manager 3.1
标准的CQ值范围：18-28之间
CQ值代表的是循环数，CQ值越大，表达量越低。
排板的方法：
1.横向基因纵向样本
sample1_repeat1|sample1_repeat2|sample1_repeat3|内参重复1|内参重复2|内参重复3|
-|-|-|-|-|-|
样本1|样本1|样本1|样本1|样本1|样本1|
样本2|样本2|样本2|样本2|样本2|样本2|
样本3|样本3|样本3|样本3|样本3|样本3|
样本4|样本4|样本4|样本4|样本4|样本4|
样本5|样本5|样本5|样本5|样本5|样本5|
样本6|样本6|样本6|样本6|样本6|样本6|
样本7|样本7|样本7|样本7|样本7|样本7|
样本8|样本8|样本8|样本8|样本8|样本8|
横向样本纵向基因
上表格式转置。
pcr程序一般采用两步法：

定量软件Bio-Rad CFX Manager3.1的使用

1.安装该软件
下载地址提取码: ppa2

运行桌面快捷方式

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然后点击开盖，自动打开pcr仪盖子，放入96孔板，点击关盖。点击protocol。

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修改pcr反应时间，反应体系体积10ul

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然后就是next-next-run

点击run,之后会弹出界面保存运行文件的位置，选择一个位置，命名好对应的样本基因编号就可以运行了。
运行结果导出
程序运行完成后，会出现如下界面：

image.png

点击Export->Export All data->Excel 2007
会弹出保存到文件夹地址的框

image.png

选择之前选择的创建文件时的文件夹保存。之后会在该文件夹生产一系列文件。

image.png

其中admin_2019-03-12 09-56-20_第三批第2板 - Quantification Cq Results.xlsx是我们要的定量的结果。

该文件的内容格式如下：

image.png

Cq值这一列是我们要的下机数据。