众所周知，测序结果不好可由从样本采集、核酸提取、文库构建、上机测序等环节中的众多细节决定。今天就唠唠测序前文库的质检。
在高通量上机测序前，为了提高测序上机的成功率，降低失败的几率（毕竟上机一次齁贵的！！！），需要对建成的文库进行全方位360°无死角的质检。
主要集中在两个方面：（1）文库浓度；（2）文库片段长度分布。
一、文库浓度
1. NanoDrop分光光度计定量
NanoDrop超微量分光光度计，是分子生物学实验室常见的仪器之一。仪器外观小巧，设计精妙，仅需1ul 样品，就能进行核酸、蛋白等浓度测定，仪器操作简单，使用方便。无数生物领域科研工作者都能熟练使用超微量分光光度计。
NanoDrop及其它紫外分光光度计均采用紫外吸光度进行检测。紫外吸收法原理是核酸、蛋白及其衍生物具有共轭双键系统，能吸收紫外光，吸光度和浓度成正比。RNA和DNA的紫外吸收峰在260nm波长处。当一束260nm的光线透过核酸样本时，会产生光吸收。根据仪器检测的光吸收值A260可轻松换算核酸的浓度。
此法操作简便，迅速，但缺点是无论是核酸（DNA/RNA）、降解的核酸、游离的核苷酸、蛋白质或其他盐离子杂质都可产生光吸收。若构建的文库不纯，则会产生文库浓度估值比实际大很多的情况。综合上述的优缺点，不建议使用该仪器进行文库浓度检测。
2. Qubit 荧光定量
Invitrogen Qubit 4 荧光计是目前备受广大研究者欢迎的台式荧光计，旨在精确定量检测 DNA、RNA 和蛋白质。最新版的 Qubit 4 荧光计还可以轻松测量 RNA 的完整性和质量（RNA IQ）。简单易用的触摸屏导航，让您轻松选择和运行实验，而且只需几秒内就会显示结果。（Thermo Fisher广告文案）
Qubit是可用于核酸和蛋白的定量，采用荧光染料检测特定目标分子的浓度，能够对DNA和RNA、蛋白进行精准定量。 荧光染料法采用只有与DNA、RNA或蛋白质结合后才发出荧光的MolecularProbes® 染料，即该荧光染料只有与特异性的靶分子结合时，才能发出荧光信号，但游离核苷酸或降解核酸存在时也可以被检测到。
由于Qubit®技术根据荧光染料嵌合到特定的分子结构，只检测靶分子的浓度，这种特异性可以获得十分精确的结果，可以作为后续测序定量的参考。但如果文库中有过多的小片段存在或者文库结构不完整，也会造成文库浓度的估算不准。但比Nanodrop的精准度提高了很多倍。
3. qPCR定量
实时荧光定量PCR技术（qPCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。
以Illumina测序平台为例，完整的文库结构是双端带有P5和P7接头。只有具备完整文库结构的分子才可以进行后续的桥式PCR扩增及测序的流程。根据P7和P5的接头序列设计引物，使用qPCR进行文库定量，这种方案定量的结果是最接近文库真实浓度的，也是上机前最推崇的定量手段。
若含有游离的接头序列也会造成文库的定量偏差，尽量做文库的片段长度筛选，去掉游离的文库接头序列）。我们曾将遇到过Qubit定量值很高，qPCR定量值很小，这就是具备完整文库结构的分子序列比较小，即有效文库占比少，造成了两种定量结果的偏差，这种情况下上机的失败率是相当高的。
综上，文库浓度定量可结合Qubit和qPCR两种方式进行文库浓度的评测。
二、 文库片段分布范围
1. 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是常用的分离鉴定和纯化DNA、RNA片段的方法。这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时受电荷效应和分子筛效应的影响，达到分离混合物的目的。当DNA分子在高于等电点的pH溶液中时会带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。
琼脂糖凝胶电泳能够对比marker的泳动条带，获得文库的片段大小范围，但不能确定文库片段大小的精确分布，灵敏度低，且无法检测含量较低的小片段和大片段，检测繁琐费时，效率低下。
2. 微流控芯片技术
Agilent 2100和Caliper芯片生物分析仪是基于微流控芯片技术的检测平台，当给芯片加入电压时，样品便在芯片上的显微蚀刻管道中进行毛细管电泳，在样品流动过程中，不同的DNA /RNA片段根据其分子长度被分离。凝胶-染料基质中的荧光染料可嵌入DNA双链，通过激光激发荧光，使其被仪器检测到，仪器依据收集到的荧光信号强度对样品定量。
微流控芯片技术通过芯片电泳的方式提高平板电泳质量，对文库每一个片段的大小进行精确测定，可对文库进行定性和定量，判断文库构建是否成功。文库测定时可根据需求，选择不同灵敏度芯片。另外微流控芯片可以一次检测多个文库，Aglient 2100一次可以上机12个文库样本。
综上，文库片段分布的检测可以使用Agilent 2100和Caliper芯片生物分析仪进行质检。
综综上，文库上机前文库浓度、片段分布以及pooling后的文库浓度是一定要评测的，只有合格的文库才有可能产生合格的数据（还关乎测序仪的状态。小编实验室就因为测序仪异常，两轮上机颗粒无收。我仿佛听到了money无声的掉落水中），定量不准会造成芯片爆掉（颗粒无收）和低Cluster Density（数据量少），所以文库质检千万不能马虎。
参考文档：http://www.bioon.com.cn/news/showarticle.asp?newsid=69651
