芦苇干旱应答蛋白质的分离和鉴定
摘 要：芦苇(Phragmites communis Trin. )是广生态幅的世界植物种,为多年生水生草本植物,其种群在湖泊、沼泽中大片分布。然而人们发现芦苇在演化过程中能够逐渐适应相对缺水的陆地环境,甚至极端陆地环境,如盐碱地、岩境,沙漠、重金属污染地等,从而形成多种陆地生态型。这种巨大的环境忍耐能力使得芦苇成为研究植物环境适应性的模式植物。本文通过研究两种生态型芦苇,即沼泽芦苇和沙丘芦苇的蛋白质组在干旱条件下的变化,探讨沙丘芦苇抵御干旱胁迫的分子机制。寻找禾本科植物干旱应答中可能存在的新基因/蛋白。我们测定了在干旱过程中的芦苇的SOD酶活力、CAT酶活力、POD酶活力和脯氨酸含量变化,认为POD活力及游离脯氨酸含量的升高是芦苇抗旱的生理证据。又通过标准2-DE技术,分别构建了两种生态型芦苇干旱处理6天的蛋白质组表达谱。与正常生长条件下的芦苇相比,发现59个上调/下调超过2倍的差异蛋白质点。经MALDI-TOF-TOF质谱分析,数据库检索,已鉴定其中25种蛋白为已知蛋白质,而其余15个蛋白质点在现有数据库中未获鉴定结果,应为未知蛋白。我们得出结论:芦苇主要通过光合作用暗反应卡尔文循环速率的迅速上升以及蛋白质翻译合成体系的活跃来应对初期的干旱胁迫，但由于Rubisco酶表达量的下降，光合作用速率随着干旱进程的持续不可避免的呈下降趋势。沙丘芦苇应答干旱的蛋白质是1,7-景天庚酮糖二磷酸酶、硫氧还蛋白过氧化物酶，一些在自然条件下的差异蛋白并不响应干旱，应该是其它胁迫如高光，极端温度的结果。
关键词：芦苇，蛋白质组，干旱胁迫
0引言
禾本科Gramineae(Poaceae)植物是人类赖以生存的粮食作物的主要来源，包括三大粮食作物水稻、小麦、玉米，以及常见农作物大麦、高梁等。此外，同属于禾本科的甘蔗和竹类也与国民经济密切相关。随着人们对资源的过度开采，全世界面临着严重的沙漠化问题，这直接导致很多禾本科粮食作物的减产，粮食问题再一次被联合国提上议事日程。植物的抗旱机制以及植物对干旱高温等不利环境胁迫的响应一-直是植物生物学研究的焦点问题。
生理研究表明,在干旱胁迫条件下，植物体内各种代谢物质都会发生变化。植物叶片含水量以及气孔导度、光合速率呈下降趋势(Osmond etal, 1981); 可溶性糖，脯氨酸和甜菜碱等渗透调节物质发生变化，有些植物大量积累脯氨酸，有些植物积累甜菜碱;植物激素，尤其是ABA,通过控制气孔关闭，诱导脯氨酸的积累，活化抗旱相关基因(Rock et al, 1994)， 在植物的干旱调控中起着至关重要的作用，是抗逆信号途径的主要介导分子。蛋白质是细胞功能的主要执行者，植物在干旱条件下，许多蛋白质被诱导/抑制表达。水稻(Oryza Sativa L.)作为世界上最重要的粮食作物之一一，与其它谷类作物有重要的同线性关系，是单子叶植物的模式植物。
水稻基因组的大小为389Mb,估计比双子叶模式植物拟南芥整个基因组序列大260Mb;总共37544个非转 座元件与蛋白质编码有关的序列被检测，与拟南芥2.8万~2.9万个基因相比较，水稻每9.9Kb一个基因的密度更低，似乎有2859个基因对 于水稻和其它谷类作物来说是特有的，其中有些在单子叶植物和双子叶植物之间可能有差异。水稻基因组序列的测定，使得研究其近缘物种基因组或者蛋白质组的难度大大降低。水稻耐旱性是指水稻植株忍受较长时间轻度缺水或者在某一发育期耐受短时期严重缺水的能力:复原抗旱性是指水稻在经过一段时 期干早后的恢复能力。在水稻受干旱胁迫过程中,从胁迫信号的感知到基因表达并产生适应性，形成了一些列复杂机制，从而最大程度地减轻千旱胁迫造成的伤害。(Datta et al, 1988）水分胁迫对于水稻的影响非常大。干旱条件下，水稻细胞膜结构遭到破坏，具体表现为细胞膜透性发生深刻变化,大量物质被动的向组织外渗透(利荣千等,2002) ;水稻幼苗生长受阻，干物质的积累减慢，而水分的缺失可以对细胞产生直接抑制正常分裂以及通过光合作用间接抑制生长两种影响(喻方圆等, 2003);呼吸作用急剧变化，呼吸速率的具体变化为胁迫的初期上升,随着胁迫的持续而又明显下降;光合作用减弱，大多数逆境胁迫都对光合作用的影响显著，光合速率下降，具体表现在原初电能光能转换、电子传递、光合磷酸化和光合作用暗反应过程均呈下降趋势(郭连旺等，1996) ;内源激素代谢失调，比如细胞分裂素(CTK)含量降低、乙烯(ETH)含量上升以及内源脱落酸(ABA)水平显著上升;核酸代谢受到破坏。当水稻受到干旱胁迫后，首先发生细胞透性变化，继而出现代谢失调，严重的还会对细胞造成机械性损伤，最终导致死亡。
1材料与方法
1.1选材理由
芦苇(Phragmites communis Trin.)是禾本科多年生草本植物，具有广泛的适.应性并已演化成不同的生态型。本研究采用的两种芦苇生态型分别为沼泽芦苇(Swamp reed)和沙丘芦苇(Dune reed)。2002年，Cui等成功建立了这两种生态型芦苇的组织培养体系，为实验室研究芦苇抗逆性机制提供了很好的材料基础。
1.2实验材料及处理方法
沼泽芦苇和沙丘芦苇的愈伤组织按Cui等(2002)方法获得。在继代培养后，进行分化，使之再生，获得再生植株。挑选生长均一的再生植株，移植在有石英砂的大烧杯中，采用1/2 Hogland营养液，继续培养至五叶期,用于干旱处理。干旱处理方式为自然干旱，将大烧杯中的营养液用吸管完全吸干，在培养室内(温度25°C，湿度40%) 放置6天。对照材料一直保持在1/2营养液中培养。
1.3药品试剂
CHAPS、IPG buffer pH3-10、硫脲来自Amersham Bioscience;尿素Urea (超纯级)、琼脂糖(低溶点)、碘乙酰胺、乙腈、Sequencing Grade Modified Trypsin、丙烯酰胺acrylamide、甲叉双丙烯酰胺Bis、DTT、SDS来自于promega;碳酸氢铵来自Sigma。
1.4含水量测定
取少许芦苇材料置于已称重的Ep管(Go)中，称重(G)，将装有材料的.Ep管放于离心浓缩仪中，65C真空抽干Ih左右，再称重(G2)。含水量(%)= [(G|- CGo)-(G2- Go)]/ (Gi- Go)
1.5叶绿素含量测定
参照Frank等(2005) 的方法测定叶绿素含量。
1.6过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物岐化酶(SOD)活性的测定
称取芦苇对照材料1g，用磷酸缓冲液(0.05mol/L, pH7.2， 含1%PVPP) 研磨匀浆后，4'C，8000rpm, 离心15min， 取上清测酶活力。SOD活力按刘鸿先等(1985) 方法测定; POD、CAT活力按蒋传葵等(1982) 方法测定。
1.7游离脯氨酸含量测定
参照张殿忠等(1990) 方法测定。
1.8芦苇叶片蛋白质提取
全蛋白质提取参照Cui等( 2009 )的分级抽提法和Hurkman和Tanaka( 1986)的酚抽提法进行结合，并加以改进。
将材料加液氮研碎成粉末状，加入少许PVP-40及含50mM Tris-HCl(pH7.8)、10% v/v甘油、1 mM EDTANa2、1 mM PMSF和2% v/vβ-巯基乙醇的抽提缓冲液I继续匀浆。对匀浆液超声两次,每次2s/2s, 10 cycles. 30min后4°C , 22400rpm,离心30min,留上清4C存。沉淀再用含有100mM磷酸缓冲液(pH7.1)、10%v/v甘油、200mM KCl、2mM MgSO4 7H2O、1mM EDTANa2、2%w/v CHAPS、1 mMPMSF和2%v/v β_巯基乙醇的抽提缓冲液II悬浮起来，再对其超声一次(2s/2s,10 cycles)。轻轻摇匀30min后，加入7M Urea、2M硫脲、30mM DTT在室温继续摇匀30min。再22400rpm离心30min，第二次离心得到的沉淀用2%的SDS悬浮，再次用同样的条件离心。三次得到的上清液混合在一起，测定提取蛋白质的含量，按照Cui等(2005)的方法，用BSA作为对照。
对上清液中的总蛋白质进行酚抽提，加入等体积Tris 饱和酚，振荡30min。再离心30min, 15000rpm, 4°C。取酚相再加入5倍体积0.1M乙酸胺(甲醇配制),4C静置至出现沉淀为止。离心30min, 15000rpm, 4C。用丙酮(含13mMDTT)洗涤沉淀两次。最后，-40C冰冻干燥蛋白质成干粉状。
