PMID: 34000456
DOI: 10.1016/j.jprot.2021.104266
摘要
化疗耐药是导致乳腺癌（BC）复发和癌症相关死亡率高的主要因素。聚糖的异常水平与化疗耐药性密切相关。糖链在化疗耐药中的基本功能尚未得到系统研究。本研究采用转录组学、蛋白质组学、糖组学和糖蛋白质组学相结合的综合策略，探讨乳腺癌细胞化疗耐药中糖基因、聚糖结构和糖蛋白的失调。在紫杉醇（PTX）耐药的MCF7细胞中，鉴定出19种差异表达的N-聚糖相关蛋白，其中MGAT4A表达下调最为显著，这与PTX处理的BC细胞中MGAT4A mRNA水平表达的降低一致。糖组学分析一致显示使用MALDI-TOF/TOF-MS和凝集素微阵列抑制多触角分支结构的水平。在PTX耐药的MCF7细胞中，鉴定出几种具有抑制水平的多触角分支结构的靶糖蛋白，并且ERK信号通路被强烈抑制。我们的发现证实了多触角分支结构及其靶糖蛋白在PTX抗性中的异常水平。系统整合的多组学分析有望促进发现异常的糖基转移酶、N-糖基化和糖蛋白在肿瘤进展和化疗耐药中的作用。意义：转录组学、蛋白质组学、糖组学和糖蛋白质组学相结合的综合策略对于理解多糖与BC化疗耐药之间的关系至关重要。在这项多组学分析中，我们确定了独特的多糖相关蛋白、多糖和糖蛋白标志物，这些标志物定义了BC中的PTX耐药性。这项研究可能为了解细菌耐药性的分子机制提供有价值的信息。
个人关注方法，感兴趣本研究可详细查看文献结果和讨论
材料和方法
细胞培养
免疫印迹和凝集素印迹
流式细胞仪分析
凝集素微阵列分析
如前所述构建和分析凝集素微阵列。简言之，来自Vector Labs、Sigma-Aldrich或Merck（德国达姆施塔特）的37种凝集素以高空间密度固定在固体载体上。关于凝集素的碳水化合物亲和力，请参考表S5。根据制造商的说明，用Cy3荧光染料（GE Healthcare；Perry Hall，MD，USA）标记蛋白质。简而言之，Cy3荧光染料在DMSO中溶解0。室温下培养5h，与蛋白质在0。1mNa2CO3溶液（pH值9.3）持续2小时。室温下5小时。通过在4℃下添加4 M羟胺10分钟终止反应◦C.通过Sephadex G-25柱纯化Cy3标记蛋白，并将其应用于凝集素微阵列。培养后，用GenePix 4000B共焦扫描仪（Axon Instruments；美国加利福尼亚州联合市）扫描载玻片。数据分析如前所述。简言之，小于平均背景值的原始值被删除。每个凝集素的有效数据中位数通过将每个中位数除以中位数之和进行标准化，并比较MCF7和MCF7-PTX细胞的标准化数据，以评估蛋白质糖基化水平的相对变化。
N-聚糖的分析
蛋白质提取与消化
如前所述，进行蛋白质提取和消化。简言之，用冷PBS冲洗细胞，用8 M尿素/1 M NH4HCO3溶解细胞，然后进行超声处理。收集上清液并用10mM DTT、20mM IAM（Sigma-Aldrich）变性蛋白质（每个样品1mg），用赖氨酰内肽酶（Wako Pure Chemical；日本大阪）在37℃下以1:100（w/w）消化4h◦C作为第一个消化步骤，然后用胰蛋白酶（Promega；美国威斯康星州麦迪逊）以1:100（w/w）在37℃下消化过夜◦C.通过离心收集肽，并使用Oasis HLB筒（Waters；美国马萨诸塞州米尔福德）进行纯化。
数据独立采集的蛋白质组学分析（DIA）
为了生成质谱（MS）库，首先进行了数据相关采集（DDA）的LC-MS/MS分析。肽在10mM NH3中重新悬浮⋅H2O，并以100μL/min的速度加载到C18柱（Xbridge BEH300；Waters）上，使用Ultimate 3000 HPLC（ThermoFisher）。缓冲液a为10 mM NH3⋅H2O；缓冲液B为10 mM NH3⋅90琋中的H2O。以1分钟的间隔手动收集分数，并连接到18个分数。将每个部分溶解在加载缓冲液（0.1% FA）中，并以1:10（v/v）与iRT肽（Biognosys；Schlieren，Switzerland）混合，并将其置于带有2μm PepMap C18珠的纳米柱中，并用EASY nLC 1200系统（ThermoFisher）以以下梯度分离：0-4分钟，3-6%B；4-137分钟，6-30%硼；137–147分钟，30%–90%，147–150分钟，90%–90%；总梯度为150min。在Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS（ThermoFisher）上，采用数据相关方法和最高速度模式获取MS数据，参数如下：喷雾电压2kV；S透镜射频电平30；毛细管温度300◦C全扫描分辨率60000 m/z 200，自动增益控制（AGC）4e5，最大填充时间30毫秒；全质量范围为350–1500；HCD以m/z 200和AGC 5E4扫描分辨率15000；HCD扫描的最大离子注入时间为30 ms；固定第一质量110；归一化碰撞能量（CE）30；MIPS“肽”；具有单一、未分配电荷状态的前体离子从碎片选择中移除；动态排除40s；循环时间3s。使用MaxQuant软件包（V.1.5.6.0）[33]分析DDA数据。蛋白质和肽的错误发现率（FDR）设置为1%。碎片光谱由Andromeda搜索引擎与瑞士Prot人类数据库（V.201502；20534条目）结合262种常见污染物进行搜索。生成的MaxQuant MS/MS.txt文件导入到软件程序Spectronaut V.13（Biognosys）中，默认设置用于生成光谱库。
为了对DIA进行LC-MS/MS分析，使用与上述DDA相同的LC分析肽。如上所述，在Orbitrap Fusion MS上获取DIA。每个MS循环包含一个完整的MS（R 60000@200 Th，AGC为2e5，最大离子注入时间为20 MS，质量范围为350–1200，标准化CE为32%，MS2 200–2000的质量范围）和80次直径扫描（R 30000@200 Th，AGC为5E5，最大离子注入时间为55 MS）。循环时间约为6周。使用Spectronaut V.13[34]对47个s.DIA文件进行了定位，并使用生成的光谱库进行了提取。原始MS数据文件使用HTRMS转换器（Biognosys）转换为HTRMS文件。HTRMS文件已导入Spectronaut，参数设置为默认值。使用Q值0过滤DIA结果。01表示肽和蛋白质水平。
糖肽富集及LC-MS/MS分析
蛋白质相互作用网络分析
如前所述进行网络分析。简单地说，蛋白质相互作用网络是从STRING数据库中提取的，置信限为0.4（medium confidence level in STRING）表示所有显著表达的蛋白质。使用Clustermaker2在Cytoscape中的Network上执行MCL聚类。使用Cytoscape中的STRING应用程序进行GO富集分析，并使用FDR值突出显示显著富集的生物过程。
GEO数据分析
基因表达谱数据GSE116446(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE116446)，基于GPL571平台数据(Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array)和R(v.4.0.3)中的Geoquery，从NCBI的Gene expression omnibus (GEO)上下载。基因表达数据作为Series Matrix数据存储，用于基因表达倍数变化分析，基因表达倍数变化定义为一个细胞系在每个时间点药物暴露与相应的零浓度之间的log2表达差异。
磷酸激酶阵列分析
根据制造商的说明(ARY003B; R&D Systems; Minneapolis, MN, USA)。使用Image J软件程序(NIH)对结果进行计算和量化。通过将重复点的平均强度除以阵列上参考点的平均强度，将数据归一化，并表示为相对于阵列上参考点的平均强度。
数据分析
所有的实验都至少重复了三次。两组间糖组数据集比较采用双尾t检验，p <0.05为差异有统计学意义。蛋白质组和糖蛋白组数据集的比较采用benjamin - hochberg (BH)方法进行多重比较FDR校正，认为与Benjamini-Hochberg FDR <0.05差异有统计学意义。采用GraphPad Prism V. 7.0软件程序进行统计分析。
