2023年3月10日，来自波多黎各大学Van Belleghem等多团队合作在国际顶级期刊《Science》上在线发表了题为“High level of novelty under the hood of convergent evolution”的研究论文。该研究将ATAC-seq和RNA-seq数据与泛基因组分析结合，展示了袖蝶属蝴蝶的染色质结构的相似性和发育过程中翅膀和前翅的染色质可及性和基因表达的差异，通过功能实验鉴定和验证了一个新的功能CRE在趋同表型中的调控机制。
研究背景科普
诗神袖蝶（Heliconius melpomene），又名红带袖蝶，属于蛱蝶科袖蝶属的一个物种。世界著名“有毒”蝴蝶，主要分布在巴西一带，该物种已有数百万年的历史。红带袖蝶从外表上看，体色红、白、黑相间，色彩徇烂。翅膀上的亮红色是对潜在的敌人发出警告，这个信号的传递称为警戒作用。艺神袖蝶（Heliconius erato）是袖蝶属的另外一个成员，诗神袖蝶和艺神袖蝶互相拟态，它们各自有 5 种翅膀颜色图案，并且一一对应，故很难辨认。
随着物种分化、突变积累，在一个物种发育过程中受到严格调控的基因、调控元件或途径在另一个物种中可能不会受到类似的限制，这些遗传变化可以产生不同的基因组环境，但仍然是相同表型的基础，这一过程被称为发育系统漂变(DSD)。趋同进化的案例使人们能够研究自然选择如何在独立谱系中产生生物相似性，尽管基因组环境不同。这一悬而未决的问题对理解促进生物多样性的分子机制具有重要意义。染色质重塑在决定细胞特性方面起着关键作用，它可以将顺式调控元件（CREs）暴露给转录因子（TFs）调控基因表达，从而揭示基因突变和发育过程之间的重要联系。在袖蝶属（ Heliconius）中，拟态物种通过一组共享的颜色图案基因独立地进化出几乎相同的翅膀颜色图案，这种趋同进化为研究适应性多样化过程中CRE进化和功能提供了一个机会。
该研究以来自巴拿马的一对拟态袖蝶属蝴蝶（H. erato，地理变种demophoon 和 hydara ；H. melpomene，地理变种melpomene和rosina）为研究对象，它们大约在1110万年前发生分化，并在前翅图案模式上趋同。研究采用ATAC-seq技术，绘制了两种蝴蝶各组织各发育阶段的染色质可及性变化图谱，结果发现染色质在发育过程中高度动态重塑。
为了探索两种蝴蝶间染色质结构的差异，研究采用了泛基因组组装的方法比较了艺神袖蝶（ H. erato）和诗神袖蝶（ H. melpomene ）诗神袖蝶之间ATAC-seq峰的位置和DNA序列的保守性。发现了大量的物种特有的染色质开放区域，且这种不同的染色质结构均匀分布在21条染色体上，这些特异的peaks一般发生在泛基因组比对中保守性较差区域。同时特异与共有的peaks有类似的差异倍数的变化，这表明它们有类似的染色质可及性的变化。这些结果说明了物种间染色质结构分歧的广泛存在是由基因组序列进化强烈驱动的。
随后，为了比较物种间翅膀发育的染色质结构，研究首先分析每个特定物种的前翅和后翅染色质之间的差异。正如从翅膀的共同本体发育过程中所预期的那样，在两个物种的前翅和后翅之间均只有不到0.5%的peaks有明显差异，两个拟态袖蝶的翅膀间分别有1563个和972个差异peaks，仅有7.2%（183个）的peaks是共享的。这些包括潜在重要的翅膀发育基因附近的峰，如前翅中Dll、pan、ds和后翅中Ubx、al、spen、wge、ci。在后翅中开放性更强的peaks主要集中在Ubx基因的100kb范围内，该基因被认为是昆虫后翅特异性的一个关键基因，在该基因附近发现了36个物种特有的peaks。对前翅和后翅间差异peaks进行TF结合motif富集分析也显示了两种拟态袖蝶间的不同，利用RNA-seq检测到物种间前后翅的基因差异表达模式也证实了染色质可及性的差异，其中包括motif富集预测到的TFs，这些基因显示出被附近的CREs激活或抑制的模式。这些结果显示，Ubx基因座的染色质可及性保持不变，但在两种袖蝶中前翅和后翅之间存在大量差异的peaks。该结果表明，这些拟态蝴蝶翅膀之间的调控已经差异进化，这可能包括Ubx基因座本身的一些功能变化。
接下来，为了研究拟态前翅红色带模式的发育结构（基因和CREs），作者收集并分析了两个物种36小时蛹的前翅部分的ATAC-seq和RNA-seq数据，拟态间差异的染色质结构和表达基因展示了不同的结构模式。比较前翅不同部位的差异peaks和表达基因时，发现共享的差异peaks和表达基因分别仅有3.3%和0.3%。同时利用前翅部位数据研究了这两个拟态物种中WntA敲除后不同行为，结果发现WntA功能丧失后仅在H. erato中导致红色条纹的扩展和前翅近端的optix表达，同时前翅近端和中间共享的差异peaks在H. erato中有247个，但在H. melpomene中为0，这与表型结果相符和，再次证明两只袖蝶中前翅近端黑色存在不同的调控结构。除了Med、bab1和hb外，H.erato和H.melpomene在翅膀部分没有发现共同的TF motifs富集模式。从这些分析结果可以看出，自从它们在大约1110万年前分化以来，相同翅膀图案表型却对应不同的调控结构和基因表达模式已经进化出来。
最后，为了进一步探究拟态蝴蝶间调控结构的广泛差异对适应性进化的影响，研究聚焦在"红色"颜色模式基因optix的调控。在optix基因周围320kb的关联区间内，分别在H. erato和H. melpomene中发现了106和93个peaks。在optix基因下游155.5kb有一个被假定为前翅红色带调控的候选区域，并且在H. erato的FM部分有明显的染色质可及性差异。用CRISPR-Cas9对这一候选CRE和附近另外2个候选位点进行了功能验证，结果表****明optix附近的模块化CRE是诱导红色带表型的必要条件。H. erato optix CRE的系统发育分析将黄色或红色表型的种群或谱系种聚在了一起，这个optix CRE的序列在H. melpomene和与Heliconius属关系更远的蝴蝶物种中完全缺失，表明它出现在H. erato支系的起源。这些结果展示了H. erato中适应性CRE的进化，论证了其在趋同形态过程中翅膀颜色模式基因的独特调控整合作用。谱系间适应CRE独立进化****积累了不同的遗传变异，改变了最初共享的发育系统。**
总之，该研究对两对在地理上重叠且翅膀图案几乎相同的袖蝶属蝴蝶进行ATAC-seq和RNA-seq联合分析，以评估基因表达和调控的守恒。尽管在四个亚种中，许多相同的基因都与翅膀的模式有关，但发现在不同发育阶段以开放染色质为代表的潜在调控区域通常不共享。同时还在单一谱系中发现了一个新的增强子，并通过CRISPR基因编辑实验证明了该CRE的功能。该工作强调了进化轨迹的高度灵活性，这可能是任何生物系统的普遍特性。
