中科基因检测培训小结

一、样品的接收、制备和留样

1、 检测的准确性：人机料法环+合格样品，是关键。

2、 样品的保存与运输：24小时内，4℃快运；24小时以上，冷冻。用于细菌检测的样品不能冷冻，全血应避免与冰袋直接接触。

3、 动物组织，要做到死亡2小时采样 。

4、 采样防污染，需三重包装，标注需装在第二层包装。

5、 加样的顺序：先阴性，再样品，最后加阳性。

6、 送样时，样品标记要清楚，尽可能详细，方便检测出现问题时溯源。

7、 样品接收后，打开包装前，要使用有效消毒剂进行表面消毒，再无菌取样。

8、 样品的留样要按储存要求存放，出报告15天后可以处理。

二、禽病常见实验室检测方法介绍

1、 凝集性试验 ：抗原与相应抗体结合后，在适量电解质存在的情况下，相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集试验 。

2、 血凝和血凝抑制试验，主用于新城疫和禽流感的抗体效价评估；

3、 沉淀试验:可溶性抗原与相应抗体结合，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀试验。法氏囊和马立克主用此方法。

4、 酶联免疫吸附试验分为直接法、间接法、竞争/阻断法、夹心法。

5、 实验室监测方案的制定，进行免疫检测，可在免疫前检查和免疫后14-21天检查。

6、 禽病实验室检测分析，需主要对新支流法进行检测。

三、非瘟核酸检测原理、操作及要点

1、 非瘟基因组大，双链DNA，基因型基于VP72编码基因，可分为24个基因型。

2、 PCR检测技术发展：普通PCR（定性）、荧光PCR（相对定量）、数字PCR（绝对定量）。

3、 非瘟检测防污染可采取3个步骤：准备带盖的消毒废液缸处理；带盖的消毒废液桶处理；肉排式高压灭菌锅处理。

4、 荧光PCR的设计：分区、分人、分物、分色。

5、 实验室设计最好要有缓冲区、正负压通风。

6、 在可能产生气溶胶的操作必须使用生物安全柜。

7、 在生物安全柜里操作时，污染物放置紧邻出风口，在回风槽附近操作。

8、 污染防控与处置：紫外线、UDG酶、次氯酸钠、75%酒精沉降。

9、 荧光PCR检测操作五字决：温、混、纯、准、稳。

10、非瘟净化检测：通检，P72基因，检测—淘汰—净化，结合抗体检测，制定综合检测方案。

四、血清学检测原理、操作

1、ELISA原理：待检物与固相载体表面的抗原或抗体结合，再加入酶标抗原或抗体结合，再通过加入与酶反应的底物显色，进行定性或定量分析。

2、固相载体的要求：结合抗原或抗体的容量大；抗原或抗体能牢固固定在其表面；不影响抗体或抗原的免疫反应性。

3、常用标记酶：辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。

4、间接法是最常用的方法。

5、双抗体夹心法：检测各种蛋白质大分子，抗原必须拥有两个以上的抗体结合位点。

6、ELISA检测显色加样计时从加入第一孔开始。

7、加完终止液后，须在10分钟内完成读数。

8、ELISA检测，5天内测定的血清样本可放置4℃，超过一周测定的需低温冰存。

9、血凝特性：病毒能使红细胞发生凝集的特性称为病毒的血凝特性。血凝试验的原理：病毒表面有血凝素，能与鸡、豚鼠、人等红细胞表面受体结合，从面使红细胞出现凝集现象。

10、血凝抑制原理：病毒表面有血凝素纤突，遇到相应抗体时，血凝素纤突抗原与抗体结合，在遇到红细胞时，无法再与红细胞表面受体结合，从而不能使用红细胞发生凝集。

五、细菌的分离、鉴定与药敏试验

1、平板划线有分区划线法和连续划线法。

2、划线接种时，接种环与培养板表面㕵15-20度斜角，划线动作要轻。

3、致病菌确定原则 ：常见致病菌；同一动物不同组织或同一个场不同个体动物均检出的菌；

数量多，优势菌；结合发病动物的临床症状，确定原发病原或继发病原。

4、平板的保存：2-8℃密封保存2-3周，使用前需提前回温。

5、菌悬液制备，必须 是生长良好的单菌落或纯化后的菌苔。

6、平板涂布，用蘸有菌液的拭子涂抹培养基的表面，每次旋转平板约60度，确保搁液涂抹均匀。

7、贴药敏纸片后，将培养皿置于37℃培养20-24小时。

8、药敏的结果判定，不规则的抑菌圈，取最大和最小直径的平均值；双抑菌圈，以内圈直径为判定，或有不连续菌落时，应将细菌继续纯化后重新做。

9、水质菌落总数用平板计数法检测，采用10倍梯度稀释。

10、水质大肠杆菌检测，采用多管发酵法检测。