一、数据准备
1、Mapping文件
Mapping文件为描述测序样本信息的文件，“数据的数据”，文件格式为.txt，需手动建立，其基本格式如下：
其中前三列与最后一列为必备列，分别为样品名，Barcode序列，引物序列，以及样品描述信息，其余列可自行添加用于样品分组。
准备好的Mapping文件需使用validate_mapping_file.py检验其正确性：
validate_mapping_file.py -m Fasting_Map.txt -o validate_mapping_file_output
2、测序结果文件
一般情况下，我们得到的是测序公司提供的已分割好的数据，测序公司会提供已拼接完成的.fastq格式文件，每个样品单独一个文件。
将测序文件单独放在某一文件夹下，进行初步的质控、文件合并以及格式整理以用作下一步分析，该步骤通过multiple_split_libraries_fastq.py命令实现。
multiple_split_libraries_fastq.py -i input_files -o output_folder --demultiplexing_method sampleid_by_file --read_indicator _R1_ --sampleid_indicator _
其中--read_indicator参数为序列文件名中代表性的特征字符，用于区分该文件夹下其他文件；--sampleid_indicator参数为序列文件名中某一字符，其用途为该字符前面的字符将作为后续分析的样品ID，例如sample1_L001_R1_001.fastq.gz，_R1_为表征该文件为序列文件的特征字符， _之前的sample1作为该文件对应样品的样品ID。
该步骤运行结果可得到一个.fasta格式文件，包含所有样品所有序列，其序列名基本格式为
><sample_id>_<unique_seq_id>
二、OTU划分
可以利用上步得到的.fasta格式文件直接划分OTU，可使用pick_de_novo_otus.py命令：
pick_de_novo_otus.py -i $PWD/seqs.fna -o $PWD/uclust_otus/
该命令为一workflow，具体包含以下7条命令：
1、pick_otus.py
pick_otus.py -i seqs.fasta -o picked_otus_defaul
第一步为OTU划分，-m参数设置划分方法，默认采用uclust方法，-s设置相似度阈值，默认值为0.97。该步骤所得结果文件为：seqs_otus.txt与seqs_otus.log文件。seqs_otus.log为日志文件，记录相关参数，seqs_otus.txt文件每行包含OTU_ID以及该OTU下包含的序列名，基本格式如下：
2、pick_rep_set.py
pick_rep_set.py -i seqs_otus.txt -f seqs.fasta -o rep_set1.fasta
第二步为挑选出每个OTU的代表序列，所有OTU均有一条代表序列，合并为一个文件，序列名为>OTU_ID sequence_ID文件基本形式如下：
3、align_seqs.py
align_seqs.py -i $PWD/unaligned.fna -t $PWD/core_set_aligned.fasta.imputed -o $PWD/pynast_aligned_defaults/
第三步是对上一步得到的代表序列进行对齐操作（Alignment），得到一个已对齐的.fasta文件，-m参数设置方法，默认方法为PyNAST。
4、assign_taxonomy.py
assign_taxonomy.py -i repr_set_seqs.fasta -r ref_seq_set.fna -t id_to_taxonomy.txt
第四步是进化分类，根据上步得到的代表序列，确定每个OTU的进化分类，-m参数设置方法，默认采用uclust consensus taxonomy assigner ，也可以设置采用RDP方法进行分类。该步可得到一log文件和Assignment文件，其形式如下：
5、filter_alignment.py
filter_alignment.py -i seqs_rep_set_aligned.fasta -o filtered_alignment/
第五步是对第三步得到的Alignment文件进行剪切，去掉alignment序列中的空格（Gaps)，用于下一步构建进化树。
6、make_phylogeny.py
make_phylogeny.py -i $PWD/aligned.fasta -o $PWD/rep_phylo.tre
利用上步得到的文件构建进化树，-m参数设置建树方法，默认采用fasttree。
7、make_otu_table.py
make_otu_table.py -i otu_map.txt -t tax_assignments.txt -o otu_table.biom
最后一步是生成.biom格式的OTU table，OTU table每一列为一样品，每一行为一OTU以及该OTU在各样品中出现的次数。输入文件为第一步得到的文件。
由于在下一步骤中还需进行质量控制，所以主要用于下游统计分析的第5、6两步可以暂时跳过。
