核酸及蛋白质提取中的试剂作用

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DNA提取
1.EDTA
螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子；
抑制脱氧核糖核酸酶（DNase）对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）；
EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

2.SDS
SDS是离子型表面活性剂;
溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白,从而破坏细胞膜；
解聚细胞中的核蛋白；
SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来；
但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。

3.NaCl
根据不同浓度的氯化钠溶液对DNA和蛋白质的溶解度不同原理，可以在提取不同类型DNA使用中加以利用。
（1）NaCl是常用的盐析材料之一，盐析即在高浓度NaCl溶液中，蛋白质析出的现象。原理如下
a.NaCl溶液与蛋白质争夺水分子，破坏蛋白质胶体颗粒表面的水膜；
b.NaCl溶液大量中和蛋白质颗粒上的电荷，从而使水中蛋白质颗粒积聚而沉淀析出；
（2）不同浓度下DNA分子构象（三维结构）不同，不同的构象溶解度也不同。
a.当NaCl溶液的浓度为0.14mol/L时，DNA溶解度最小，因此改变NaCl溶液的浓度既能使DNA溶解也能使其析出；
b.DNA在不同浓度的氯化钠溶液中随着氯化钠的浓度不断升高；
（3）所以可以使用适当的高浓度NaCl溶液，使得蛋白质析出，而DNA溶解度较大，通过高速离心，取上清并去除沉淀，进而去除蛋白质。
（4）在蛋白提取中加150mM NaCl，一方面这一浓度是生理浓度，可以提供等渗环境，另一方面这一浓度下DNA的溶解度小，也可以减少DNA的干扰。

4.DNA沉淀剂
原则：不与DNA反应，对其无影响。
（1）纯乙醇（二倍体积比）；效率高，需要放置的时间短，在公司用Kit提取的时候，没有放置直接进行下一步；确定是价格相对昂贵。
（2）95%乙醇，价格相对于纯乙醇便宜，但是会损失DNA；
（3）异丙醇（0.6倍体积）；
a.普通细胞上清液体，静止15-30min即可沉淀；
b.对于含量低，或者组织（比如我现在经常提取的小鼠的肝脏中的Total和cccDNA），则最好在-20℃放置2h或者以上，
本人提取肝脏组织DNA时候，最长时间放置了三天，对结果并无影响；上周提取细胞中cccDNA的时候，室温放置了15min，结果提出的DNA含量也挺高的，而且之后的Southern结果也很成功。我猜测可能是含量高，所以时间短点也可以，但是如果时间不是很着急，还是按照规定的时间来做比较保险。

RNase
Rnase可以除去溶液中的RNA，达到纯化DNA的目的；孵育条件为50℃ 30-60min。
RNase可以通过以下方法去除：
（1）SDS和KAc ;KAc可以使沉淀更彻底。
（2）SDS和NaAc ；
（3）使用饱和酚氯仿抽提，再沉淀。

TE
（1）Tris-Hcl 缓冲液里不含有Mg Ga 等金属离子（各种酶的辅助因子），因此对DNA的影响比较小；
（2）EDTA可以使DNA的保存和溶解更加稳定。

蛋白提取
根据不同的目的，裂解液的组成有所不同，主要有提取核酸和蛋白两种。在提取RNA或DNA时，我们主要是要充分裂解细胞，得到更多的核酸；如果我们的目的是蛋白，那要根据蛋白的位置、特性等因素考虑裂解液，在提取蛋白后，再根据实验需要复性蛋白等。
1.SDS

(1)SDS是阴离子表面活性剂常用于蛋白质和类脂类的电泳分离。当其与蛋白质混合,质量比达到1.4:1时，SDS能破坏蛋白质分子间以及其他物质分子间的非共价键使蛋白质的构象发生变化继而使蛋白质变性解离成单一亚基，从而降低或消除了各种蛋白质分子间的天然电荷差异。电泳常用10%的SDS作为储备液。
(2)SDS可以迅速破坏组织结构，抑制RNase和脱氧核糖核苷酶（DNase）活性，所以SDS也是核酸纯化试剂的关键组分。通常使用10%或者20%的SDS储备液，SDS的工作浓度是0.1-0.5%。

2.NP-40
NP-40是很温和的去垢剂，1%浓度的基本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱，结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。

3.Triton X-100
TritonX-100的能力介于NP40和SDS之间，偏向于NP40，也是常用的细胞裂解液成分之一，在保护蛋白活性方面有一定作用（SDS基本会使蛋白变性失活）。

4.尿素和硫脲
盐酸胍和尿素对疏水氨基酸残基的增溶作用，因为盐酸胍和尿素具有形成氢键的能力，盐酸胍和尿素在高浓度(4～8mol/L)水溶液时能断裂氢键，结果盐酸胍和尿素就成为非极性残基的较好溶剂，使之蛋白质分子内部的疏水残基伸展和溶解性增加，从而使蛋白质发生不同程度的变性。

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