客户：龙宝，我想要做荧光共定位，检测两个指标的表达和相互作用情况，该怎么选择抗体呢？有什么要注意的呢？

龙宝：

首先我们来回顾下，什么是免疫荧光和荧光共定位？

1. 免疫荧光：

是一种常用的细胞和组织学研究方法，用于观察特定蛋白或分子在生物样本中的位置和表达水平。其基本原理是利用免疫学原理，即利用专门设计的抗体与目标蛋白或分子结合，然后通过荧光染料标记的二抗来可视化这些特定蛋白质。通过荧光显微镜观察，可以立即看到目标蛋白在样本中的位置和表达水平。

2. 荧光共定位：

有时候需要观察多个蛋白或分子在样本中的位置关系，这时就需要进行荧光共定位。在这种情况下，不同目标蛋白会分别使用标记了不同颜色荧光染料的二抗，然后通过荧光显微镜观察。例如，如果需要观察蛋白A和蛋白B之间的相互作用或共定位关系，可以使用标记红色和绿色荧光染料的二抗来标记这两种蛋白，然后在显微镜下观察它们的位置关系。

通过免疫荧光和荧光共定位技术，研究人员可以在细胞和组织水平上详细研究蛋白之间的相互作用、功能以及位置关系，从而帮助更深入地理解生物学过程。

确认实验方法：直接法or间接法？

· 间接法：如上述原理中提到的，使用不带荧光标记的一抗与抗原结合，再通过两种带有不同荧光的二抗与一抗结合的方法就是间接法。虽然操作步骤稍多，但信号放大效果好，二抗选择范围广，性价比高。

· 直接法：利用两种带有不同荧光的直标一抗与抗原结合。这种方法操作简单、耗时短、特异性高、背景低。但信号放大效果有限，直标抗体的选择范围较窄，价格较高。

选择合适的抗体

注意事项1：如果选用间接法，需要确保所选的两种荧光抗体互不干扰，避免交叉反应等。直接法不需加二抗，则不需考虑此项。

注意事项2：选择合适的荧光通道，避免荧光串色至关重要。荧光探针应该选择发射光谱分离比较大的且具有最小叠加的组合，通常选择绿色和红色作为主要通道，叠加区域显示黄色，而且人眼对绿色和红色色调更为敏感。此外，蓝色和绿色可形成青色，蓝色和红色可形成紫色。但考虑到人眼对蓝光的灵敏度较低，且DAPI常被用作细胞核的蓝色荧光标记，蓝色通道不常用作主要通道。选择合适的荧光染料还需考虑设备的配置，及目标蛋白的表达情况，荧光染料高度有强弱之分，抗原表达有高低区别，因此，对于一些低表达的抗原，我们在搭配对应抗体的染料时，应该选择荧光较亮的染料。

示例：

· 直接法：直接选择带有不同荧光基团的抗体，如FITC-A抗体和PE-B抗体。

· 间接法：选择不同种属来源的一抗，如鼠抗A抗体和兔抗B抗体，再根据一抗种属选择对应的荧光二抗，如AbBox Fluor 488-山羊抗小鼠二抗和AbBox Fluor 594-山羊抗兔二抗。确保一抗和二抗之间的特异性结合，避免交叉反应。

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附录：细胞免疫荧光操作步骤（供参考，请根据实际情况调整）

1、爬片：消化细胞于玻底培养皿，保证玻片上的细胞以单细胞层生长，细胞密度以达到75%-85%最佳。

2、固定：吸去培养皿中的培养基，用PBS清洗2-3遍。每个培养皿中加入4%多聚甲醛，室温静置15分钟，结束后用PBS清洗2-3遍。

3、透化：每个培养皿中加入1 mL 0.1%皂苷（或Triton X-100 等，溶于PBST中）透化细胞10-20分钟，结束后用PBS清洗2-3遍。注：如果是检测细胞质蛋白或者细胞膜蛋白的胞内段需要做此步骤。

4、封闭：每个培养皿中加入1 mL 1%-3% BSA（或同物种血清溶于PBST中）室温封闭30分钟，结束后除去BSA。

5、一抗孵育：在培养皿中滴入用1%-3% BSA（溶于PBST中）稀释好的一抗，4 ℃过夜孵育。一抗孵育结束后，1 mL PBS清洗2-3遍。

6、二抗孵育：按照实验需求，加入对应的荧光二抗（用1%-3% BSA的PBST稀释），室温避光孵育2小时，孵育结束后用PBS清洗2-3遍，每次5分钟，此过程以及余下的操作应全程避光。

7、DAPI染细胞核：在清洗完毕的细胞中滴加DAPI，室温避光静置约30秒，之后用PBS清洗2-3遍，每次5分钟。

8、封片：在细胞上滴加一滴抗荧光猝灭剂，晃动培养皿，使其均匀覆盖在细胞表面，盖上盖子。激光共聚焦系统记录结果。

希望以上内容能够帮助您更好地理解和应用免疫荧光共定位技术。