肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）早期复发仍然是一个具有挑战性的领域，其中涉及的机制尚未完全被理解。尽管微血管侵犯（Microvascular invasion，MVI）与HCC早期复发相关，但缺乏用于诊断和预后评估的理想生物标志物。DNA甲基化和长链非编码RNA（lncRNA）作为表观遗传调控因子，在HCC中的表达变化与疾病发病机制密切相关。因此，鉴定可以预测肝癌患者预后的DNA甲基化位点，并阐明驱动HCC侵袭性的分子机制至关重要。
近日，《Experimental & Molecular Medicine》期刊发表了题为“VIM-AS1, which is regulated by CpG methylation, cooperates with IGF2BP1 to inhibit tumor aggressiveness via EPHA3 degradation in hepatocellular carcinoma“的研究论文，该研究探讨了在肝细胞癌（HCC）中，通过CpG甲基化调控的非编码RNA VIM-AS1（vimentin antisense RNA1）（一种1.8 kb长的非编码RNA）与IGF2BP1合作，通过EPHA3降解来抑制肿瘤侵袭性。研究发现，VIM-AS1高甲基化与HCC预后不良相关，并能够通过影响EPHA3 mRNA稳定性来调控HCC侵袭性。
标题：VIM-AS1, which is regulated by CpG methylation, cooperates with IGF2BP1 to inhibit tumor aggressiveness via EPHA3 degradation in hepatocellular carcinoma（VIM-AS1 受 CpG 甲基化调控，与 IGF2BP1 协同作用，通过降解 EPHA3 抑制肝细胞癌中的肿瘤侵袭性）
期刊：Experimental & Molecular Medicine（Exp Mol Med）
影响因子：IF 9.5
技术平台：BS、ChIP-seq、MeRIP-seq分析、RNA-seq等（易基因金牌技术）
本研究首先利用CGRC和TCGA数据库中HCC患者样本的DNA甲基化数据，鉴定出HCC中的高甲基化CpG位点。数据分析结果揭示了cg02746869是VIM-AS1的关键调控位点。调控VIM-AS1表达的HCC细胞RNA-seq测序揭示了EPHA3是VIM-AS1的病理靶标，在HCC中发挥致癌作用。高甲基化导致的VIM-AS1表达抑制显著影响HCC细胞动态变化，尤其损害细胞的移动性和侵袭性。从机制上讲，VIM-AS1表达降低通过增强IGF2BP1与EPHA3 mRNA的结合来稳定EPHA3 mRNA，导致EPHA3 mRNA表达增加，并促进HCC进展。进一步体内实验证实，VIM-AS1-EPHA3轴调控HCC的肿瘤生长和肿瘤微环境。以上研究结果表明，cg02746869位点高甲基化导致的VIM-AS1下调通过m6A依赖性机制增加EPHA3 mRNA表达，从而增加HCC侵袭性。
结果图形
（1）cg02746869 甲基化状态调控VIM-AS1在 HCC 中的表达
图1：DNA甲基化分析揭示HCC患者VIM-AS1中cg02746869位点的高甲基化状态。
a. 根据CGRC和TCGA数据库的甲基化组数据，示意图显示在HCC中鉴定出的50个高甲基化位点（左图）；50个高甲基化位点位于CpG islands、CpG shores、CpG shelves和open sea区域（中间图）；50个高甲基化位点与转录起始位点（TSS）之间的距离分布（右图）。
b. 在多种恶性肿瘤中cg02746869位点的beta值分析。
c. 热图表示不同类型癌症中VIM-AS1表达和cg02746869甲基化模式（左图）。cg02746869位点的beta值与VIM-AS1表达水平的相关性分析（右图）。
d. 在THLE2和HUH1中cg02746869位点的甲基化和相关VIM-AS1表达。
e. 在DNMT3A实验组中使用HRM和BS-seq验证甲基化水平增加，并检测到VIM-AS1表达下调。在TET1实验组中使用HRM和BS-seq验证甲基化水平下降，并验证了VIM-AS1表达。
f. H3K27ac
and H3K4me3的ChIP-seq基因组浏览器显示THLE2和HUH1中cg02746869位点活性标记富集结果。
g. 甲基化和去甲基化后cg02746869位点的ChIP-qPCR用于评估组蛋白活性和转录因子（TF）结合。Con =对照组，DNMT3A
= 高甲基化cg02746869位点，TET1 = 低甲基化cg02746869位点。
（2）VIM-AS1过表达抑制癌细胞侵袭性
图2：VIM-AS1水平整体升高进而下调与细胞粘附相关的基因。
a. 使用FISH检测VIM-AS1定位的代表性图像（左图）。VIM-AS1相对强度，表示亚细胞定位的百分比（中间图）。THLE2和HUH1之间每种亚细胞定位强度比较（右图）。
b. 通过qRT-PCR（左图）和RNA-seq（右图）验证VIM-AS1过表达细胞。
c. 在VIM-AS1过表达后上调和下调基因的差异表达基因（DEG）相关性分析图（左图）。红色=前5个上调基因；蓝色=前5个下调基因。VIM-AS1下调的DEG的GO分析（右图）。
d. 与细胞粘附相关下调DEG的GSEA结果。
e. VIM-AS1过表达细胞中细胞粘附相关基因qRT-PCR。
f. 迁移和侵袭实验的代表性图像和定量分析。
（3）VIM-AS1 调控EPHA3 mRNA稳定性
图3：VIM-AS1调节EPHA3
mRNA稳定性，与HCC预后不良相关。
a. THLE2、HUH1以及甲基化修饰样本中EPHA3
mRNA相对表达量。显示EPHA3 mRNA表达量对VIM-AS1调控的响应变化。VIM-AS1 OE = VIM-AS1过表达，VIM-AS1 KD = VIM-AS1敲低。
b. 使用放线菌素D处理HUH1细胞后EPHA3 mRNA的RNA稳定性实验。
c. VIM-AS1过表达后EPHA3蛋白的免疫印迹图。
d. EPHA3
mRNA敲低后的细胞迁移和侵袭实验。
e. 使用GEPIA分析了不同阶段VIM-AS1和EPHA3 RNA的表达量。
f. Kaplan-Meier生存曲线分析所有HCC患者以及微血管侵犯（MVI）患者EPHA3 mRNA预后生存率。
（4）EPHA3 mRNA稳定性通过 IGF2BP1 与 m6A 位点结合来确定
图4：IGF2BP1以m6A依赖性方式破坏EPHA3 mRNA稳定性。
a. 基因组浏览器快照显示GSE928399中HEK293T细胞EPHA3 MeRIP-seq的m6A修饰位点（顶部），使用RM2Target预测m6A位点（中间）以及实验靶向的3′UTR m6A位点区域（底部）。EPHA3的3′ UTR的MeRIP-qPCR结果。
b. HCC肿瘤组织（T）相对于正常组织（N）中m6A修饰因子的差异表达；FC=倍数变化。
c. RIP-qPCR实验显示HUH1细胞中与IGF2BP1结合的EPHA3和VIM-AS1 RNA。
d. IGF2BP1沉默对EPHA3 mRNA表达的影响。
e. 对包括m6A位点在内的EPHA3 3′UTR野生型（WT）和突变型（MUT）构建体的MeRIP-qPCR分析。
f. 在IGF2BP1沉默后使用WT和MUT构建体进行的荧光素酶实验。
（5）VIM-AS1 干扰 IGF2BP1 与EPHA3结合
图5：VIM-AS1通过抑制IGF2BP1与EPHA3 mRNA的互作来调节EPHA3 mRNA表达。
a-b. RIP-qPCR实验显示，在HUH1细胞中VIM-AS1过表达（a）和在THLE2细胞中VIM-AS1敲低（b）后，VIM-AS1和EPHA3
mRNA对IGF2BP1的结合亲和力。
c. 示意图显示VIM-AS1表达增加/减少对EPHA3 mRNA的影响如何通过IGF2BP1介导。
d. FISH结果显示VIM-AS1和IGF2BP1（左图）以及EPHA3 mRNA和IGF2BP1（右图）定位。条形图显示每个FISH数据集相对共定位荧光强度。白色箭头=VIM-AS1或EPHA3 mRNA与IGF2BP1共定位区域。
（6）EPHA3 mRNA在与肝细胞癌（HCC）相关的成纤维细胞中富集。
图6：VIM-AS1-EPHA3轴调控基因参与HCC侵袭性。
a. 在VIM-AS1过表达细胞和VIM-AS1与EPHA3共过表达细胞中VIM-AS1和EPHA3的相对表达量。
b. GSEA显示与细胞粘附相关的基因。红色条形=因VIM-AS1过表达而表达量减少、但在VIM-AS1和EPHA3都过表达时增加的DEGs。
c. 基因网络分析揭示，由VIM-AS1调节的EPHA3
mRNA与EPHA3 mRNA表达量一同下调/上调。
d. 与EPHA3 mRNA协同调控基因的单细胞RNA-seq图谱（GSE149614）。
（7）VIM-AS1 过表达抑制EPHA3mRNA并减少体内肿瘤发生
图7：VIM-AS1抑制肝细胞癌中肿瘤微环境的变化。
a. 每组肿瘤体积和重量变化图表。
b. 从每组切除的肿瘤图像。
c. 细胞和结构变化的HE染色切片。
d. 胶原沉积的天狼星红染色。
e. 马松三色染色及胶原沉积面积的定量。
f. α-SMA（顶部）和CD31（底部）的IF染色及定量。白色箭头= CD31阳性血管。Con=对照组，VIM-AS1
= VIM-AS1过表达，VIM-AS1/EPHA3 = VIM-AS1和EPHA3共过表达。
易小结
本研究通过BS-seq和ChIP-seq及对应的RNA-seq分析揭示了cg02746869是VIM-AS1的关键调控位点，其高甲基化与VIM-AS1的表达下调相关。VIM-AS1下调通过增强IGF2BP1与EPHA3 mRNA结合，增加EPHA3 mRNA表达，从而促进HCC进展。在HCC细胞中，VIM-AS1过表达能够降低与细胞粘附相关基因表达，并抑制HCC细胞的迁移和侵袭能力。在动物模型中，VIM-AS1过表达抑制了肿瘤生长和肿瘤微环境变化。
研究结果表明，VIM-AS1表达受CpG甲基化调控，其下调通过m6A依赖性机制增加了EPHA3 mRNA表达，从而增加HCC侵袭性。VIM-AS1和EPHA3可能作为HCC诊断和治疗的表观遗传标记。
本研究揭示了VIM-AS1通过表观遗传机制调控HCC侵袭性的新途径。确定了VIM-AS1和EPHA3在HCC进展中的重要作用，为HCC的治疗提供了新的靶点。并提供了基于表观遗传学的标志物，可能改善HCC的早期检测和预后评估。
参考文献：
Han SH, Ko JY, JungS, Oh S, Kim DY, Kang E, Kim MS, Chun KH, Yoo KH, Park JH. VIM-AS1, which isregulated by CpG methylation, cooperates with IGF2BP1 to inhibit tumoraggressiveness via EPHA3 degradation in hepatocellular carcinoma. Exp Mol Med.2024 Dec 2. pii: 10.1038/s12276-024-01352-6. doi: 10.1038/s12276-024-01352-6.PubMed PMID: 39617786.
