写在前面
最近在做GSVA，做到我有点自闭，不是因为这个算法有多难，而是他所耗费的时间有点夸张。加上校园网这两天时不时“调皮”一下，做了两次，等了四天，最后都白白浪费了。
其实后面去查了挺多资料，其实可以尝试用标准化的数据（data），而不用原始数据counts，虽然官网推荐利用raw count做，但是它耗费的时间太多了。
吐槽完，来讲一下今天的正文吧
对于一些多分组数据，我们该如何利用limma包进行差异基因分析
其实也因为我后面有这个需求，才想着做这个的分享。
我们都知道
使用limma包进行差异基因分析时，做最多的是两分类的，例如control组和disease组，但也会碰到按照序列进行的分组。这时，如果逐一使用两两比较求差异基因则略显复杂。其实开发limma包的大神们已经替我们考虑到。我自己當下limma包的PDF，仔细研读并将代码运行后分享给有需要的同道，相互学习。
- 首先加载前期预处理好的表达矩阵
library(limma)##加载包
load("GSE37761exp_groupfile-00.RData")#加载匹配过的基因表达矩阵
eset <- exp ##将基因表达矩阵赋值给eset
2.创建样本分类信息表
targets <- read.csv("group_file.csv",row.names = 1)##读入样本数据，包括两列，
#第一列GSM号，第二列为样本分组#该数据集中实际样本分组中存在24h_1、24h_5、24h_21等，然而这不符合R的命名原则
targets$Target <- gsub("_",".",targets$Target)##将"_"替换成“.”，也可以不替换
##该数据集中实际样本分组中存在24h_1、24h_5、24h_21等，然而这不符合R的命名原则，所以在没个分类前加一个“F”，具体自己定
targets$Target=c(paste0("F",c(targets$Target),collapse = NULL,sep=""))
colnames(targets)=c("FileName","Target")#更改列名，为了和limma包中的一致
lev<-unique(targets$Target)##使用unique（）函数进行去重
f <- factor(targets$Target, levels=lev)
design <- model.matrix(~0+f) #样本矩阵
colnames(design) <- lev #更改列名为levels名
这个看起来可能有点费力，换一种更清晰的形式
group_list<-read.table("gene_list.txt") #导入分组数据
new_group<- group_list[order(group_list[,1]),] #对分组数据进行排序，按照数据框的第一列升序排序
group<-new_group[,2] #取第二列，这样处理得到的就是每一个位置所对应的样本属性信息
接着，加载limma包，构造如下矩阵。
suppressMessages(library(limma))
design <- model.matrix(~0+factor(group))
colnames(design)=levels(factor(group))
rownames(design)=colnames(data)
3.构建两组间的比较矩阵
这段的代码的意思就是比较design矩阵中HC与MDD level（这里为什么只对比了两组，不是说对比多组吗？是的，当然可以对比多组（这个后面会说如何对比多组），但是对比多组后，结果得到的P值只有一个，也就是说结果里的P值是多组对比的综合P值，你不能从这个结果里获取任意两组的P值）
因此，如果大家需要获取任何两组的P值以及FC的话，个人建议每组比较单独做一个topTable
contrast.matrix<-makeContrasts("HC-MDD",levels=design)
接着跑limma的三个标准步骤，就可以得到所要的结果了
##step1
fit <- lmFit(data,design)
##step2
fit2 <- contrasts.fit(fit, contrast.matrix)
fit2 <- eBayes(fit2)
##step3
tempOutput = topTable(fit2, coef=1, n=Inf)
nrDEG = na.omit(tempOutput)
4.构建多组间的比较矩阵
##两组以上的比较，寻找差异基因，使用topTableF函数
cont.wt <- makeContrasts("F12h.1-Fcontrol",##举例
"F24h.1-F12h.1",
"F5d.1-F24h.1",
"F10d.1-F5d.1",
levels=design)
fit <- lmFit(eset, design)
fit2 <- contrasts.fit(fit, cont.wt)
fit2 <- eBayes(fit2)
tT=topTableF(fit2, adjust="BH",sort.by="F",n=Inf)
tT = subset(tT, select=c("adj.P.Val","P.Value","logFC")) #这一条和下一条代码需要根据自己需要进行更改，topTableF函数得到的结果中包括F值，而logFC则是没两组的比较，均得出了
colnames(tT)=c("FDR","P.Value","logFC")
- 保存分析好的差异表达数据。
write.table(nrDEG,"DEG_GSE98793.txt")
write.table(tT ,"tT.txt")
两种方法的全部代码：
两组表型数据差异分析
data<-read.table("GSE98793.txt")
group_list<-read.table("gene_list.txt")
new_group<- group_list[order(group_list[,1]),]
group<-new_group[,2]
suppressMessages(library(limma))
design <- model.matrix(~0+factor(group))
colnames(design)=levels(factor(group))
rownames(design)=colnames(data)
contrast.matrix<-makeContrasts("HC-MDD",levels=design)
##step1
fit <- lmFit(data,design)
##step2
fit2 <- contrasts.fit(fit, contrast.matrix)
fit2 <- eBayes(fit2)
##step3
tempOutput = topTable(fit2, coef=1, n=Inf)
nrDEG = na.omit(tempOutput)
write.table(nrDEG,"limma_GSE98793.txt")
多组表型数据差异分析
library(limma)##加载包
load("GSE37761exp_groupfile-00.RData")#加载匹配过的基因表达矩阵
eset=exp ##将基因表达矩阵赋值给eset
targets<-read.csv("group_file.csv",row.names = 1)##读入样本数据，包括两列，
#第一列GSM号，第二列为样本分组#该数据集中实际样本分组中存在24h_1、24h_5、24h_21等，然而这不符合R的命名原则
targets$Target=gsub("_",".",targets$Target)##将"_"替换成“.”，也可以不替换
##该数据集中实际样本分组中存在24h_1、24h_5、24h_21等，然而这不符合R的命名原则，所以在没个分类前加一个“F”，具体自己定
targets$Target=c(paste0("F",c(targets$Target),collapse = NULL,sep=""))
colnames(targets)=c("FileName","Target")#更改列名，为了和limma包中的一致
lev<-unique(targets$Target)##使用unique（）函数进行去重
f <- factor(targets$Target, levels=lev)
design <- model.matrix(~0+f) #样本矩阵
colnames(design) <- lev #更改列名为levels名
##两组以上的比较，寻找差异基因，使用topTableF函数
cont.wt <- makeContrasts("F12h.1-Fcontrol",##举例
"F24h.1-F12h.1",
"F5d.1-F24h.1",
"F10d.1-F5d.1",
levels=design)
fit <- lmFit(eset, design)
fit2 <- contrasts.fit(fit, cont.wt)
fit2 <- eBayes(fit2)
tT=topTableF(fit2, adjust="BH",sort.by="F",n=Inf)
##tT = subset(tT, select=c("adj.P.Val","P.Value","logFC")) 这一条和下一条代码需要根据自己需要进行更改，topTableF函数得到的结果中包括F值，而logFC则是没两组的比较，均得出了
##colnames(tT)=c("FDR","P.Value","logFC")
