1. Author
IanA. Wilson致力于研究微生物病原体的免疫识别，主要目标是利用结构解析技术，解析抗体、可变淋巴细胞直肠（VLRs）和抗原、细胞系统中与MHC I类和II类的T细胞受体复合物。以及通过模式识别受体，如TLRs，了解免疫系统对外来抗原的相互作用和中和作用，在先天免疫系统中。除此之外，IanA. Wilson的工作还集中在HIV-1和流感病毒上。他们确定了几乎所有罕见的、广泛中和的抗HIV-1包膜蛋白gp120和gp41抗体的结构，以阐明可用于HIV-1疫苗设计的脆弱位点。他们已经在所有第1组流感亚型中定义了一个广泛中和的表位，并正在研究识别第2组以及跨所有亚型的其他抗体。
2. Background
2.1 VDJ重排
入侵机体的抗原多种多样，抗体总能够特异性的识别各种抗原，其中VDJ的重拍起到了至关重要的作用。众所周知抗体重链（H）的可变区（V）发挥着识别抗原的作用，V区之所以可变是因为编码V区的DNA序列有3个基因簇，我们称为V、D、J，轻链则只有D、J两个基因簇，我们从每个基因簇中各取一个小片段重新组合便形成了识别抗原的可变区。
首先重组信号序列（RSS）可以提供重组的位点，RSS序列由3个部分构成：Heptamer、Nonamer、12/23bp基因片段。以重链为例，V、J两个区的RSS含有23bp的基因片段，D区RSS含有12bp的基因片段，根据“12/23法则“，重排会按照DJ—VDJ的顺序进行。当信号序列表达了以后，Rag蛋白会被招募发挥切割的作用。他将VJ基因之间的DNA片段切除。紧接着TdT、NHEJ发挥作用，链接切除后的切口。抗体通过VDJ重排，产生了重链，那些没有能够产生重链的B细胞会凋亡，产生重链的B细胞会匹配一个不成熟的轻链成为Pre-BCR，这时候的B细胞成为Pre-B cell，在经过轻链的VJ重拍后，形成成熟的轻链并且组装形成完整的抗体。
2.2 CR3002抗体
表面刺突糖蛋白（S蛋白）是冠状病毒的主要抗原，是病毒与宿主受体结合，介导病毒与宿主膜融合而进入宿主体内的关键蛋白；SARS-CoV-2和SARS-CoV的S蛋白在种系上密切相关，两者基因组序列一致性达到77%，如此高的序列相似性增加了SARS-CoV-2和SARS-CoV之间的引起交叉反应的抗原表位存在的可能性。CR3022，这是一种靶向SARS病毒受体结合区域（RBD）的中和抗体，以前从一名康复的SARS患者身上分离得到；最近的研究表明CR3022也可以结合SARS-CoV-2的RBD。CR3022同时使用重链和轻链上所有六个互补决定区(CDRs)与SARS-CoV-2的RBD作用，在抗原表位上的28个残基（CR3022所覆盖的残基）中，有24个（86%）在SARS-CoV-2和SARS-CoV中都保留了，表位位点的高保守性解释了CR3022的交叉反应。尽管如此，CR3022结合SARS-CoV RBD的能力高于其结合SARS-CoV-2的RBD，这种差异可能是由于两者抗原表位上的非保守的氨基酸位点，其中最主要的差异是在SARS-CoV中的N370位点存在N-glycosylation位点，N-glycan sequon(NxS/T)使得在残基372中出现不同的氨基酸，SARS-CoV中是苏氨酸而SARS-CoV-2中是丙氨酸，质谱分析表明在SARS-CoV的N-glycosylation位点中确实存在复合多糖，N370处的N-glycan将与在重链和轻链之间形成的凹槽相匹配，这可以增加与CR3022的接触，从而增强CR3022的结合亲和力。CR3022中和SARS-CoV的机制不依赖于直接阻断受体结合；事实上，已经证实CR3022可以增强其他以RBD为靶点的抗体中和SARS-CoV能力，尽管在体外试验中CR3022本身不能中和SARS-CoV-2，但是CR3022是否可以增强以SARS-CoV-2的RBD为靶标的单克隆抗体中和能力尚待确定。
3. Methods
1. SARS-CoV-2 RBD的表达纯化
2. CC12.1 和 CC12.3 Fab段的表达纯化
3. ACE2的表达纯化
4. 晶体结构解析
5. 生物膜干涉实验（BLI）
生物膜干涉实验（BLI）
抗体结合和竞争测定是通过生物层干涉测量法（BLI）进行的，使用如前所述的Octet-Red仪器（FortéBio）和Ni-NTA生物传感器。试验有五个步骤：
1）基线：60 s，用1x动力学缓冲液；
2）加载：20μg/mL的6xHis标记的SARS-CoV-2 RBD蛋白180 s；
3）基线：135 s，用1x动力学缓冲液；
4）关联：与CC12.1 Fab或CC12.3 Fab的连续稀释浓度240 s；
5）离解：240 s，用1x动力学缓冲液。对于Kd估计，使用1:1结合模型
4. Results
作者团队挑选了293个RBD抗体，对其重链可变区进行了测序。他们发现将近有10%的抗体都是Ig3-53所编码的（IGHV3-53：属于人类免疫球蛋白重链变异区（IGHV）的第3家族，第53个成员）。这表明Ig3-53基因在对抗新冠病毒侵袭的过程中起着重要的作用。
为了进一步解析这个基因编码抗体中和的分子机制，挑选了代表性抗体：CC12.1和CC12.3（CC12.1由IGHJ6、 IGKV1-9和IGKJ3编码，而CC12.3 由 IGHJ4、IGKV3-20和IGKJ1编码）。首先：①相比于亲和突变以后的氨基酸序列，CC12.1和CC12.3只有3-4个氨基酸的突变，这种高度保守的特性为其广谱性成为可能。②CC12.1和CC12.3的Fab段与RBD的亲和力达到14-17nM。③CC12.1和CC12.3的表位有别于CR3022，与ACE2重合竞争。
为了更好的说明3-53抗体与ACE2之间的结构关系，作者团队解析了CC12.1/RBD, CC12.3/RBD,
CC12.1/RBD/ CR3022, and CC12.3/RBD/CR3022四个复合体的结构。发现：①当RBD处于“up“构象时更容易与IGHV3-53抗体结合，且与ACE2竞争性结合；②IGHV3-53抗体的结合表位是SARS-CoV- 2所特有的，所以与SARS-CoV的交叉反应性较差；③CC12.3的轻链在相互作用中起到的作用较少；④CC12.1与CC12.3拥有不同的轻链，预示着IGHV3-53的轻链并不单一（拥有9种轻链）
根据结构解析结果，分析相互作用的位点，我们不难发现：①CC12.1/CC12.3的Fab段与RBD结合依靠的是互补决定区（CDR）H1、H2与RBD间的氢键；②相比于传统的IGHV3-53抗体B38，CC12.1/CC12.3发生了Y38F的突变，进而失去了一个氢键的相互作用；③CC12.1/CC12.3与RBD的互作位点有别于ACE2与RBD的。
同时作者团队开创性的明确了两个IGHV3-53特有且重要的模体——NY模体（CDRH1的32-33残基）、SGGS模体（CDRH2的53-56残基）。NY模体的32号位与RBD的A475形成氢键，同时32号位点也与VH R94形成氢键，而VH R94又与RBD上的N487和Y489形成氢键。NY模体的33号位点与RBD上的Y421、F456、L455位点相互作用。另一个模体SGGS而言，与RBD的D420、N60、Y421、R457发生相互作用。值得一提的是IGHV3-66也具有这样的两个模体结构。
同时作者也强调了CC12.1/CC12.3具有独特的短CDRH3结构特点（9个氨基酸）。这样小的短链有助于CDRH3伸入RBD的小疏水口袋中与其结合。
