刘小泽写于18.7.20
https://hemberg-lab.github.io/scRNA.seq.course/index.html

介绍

Bulk RNA-seq:

测量一个大的细胞群体中每一个基因的平均表达水平，对比较转录组学（例如比较 不同物种的相同组织） 是有帮助的，但对于研究异质性系统（例如，复杂的组织如脑）还是不够的，对于基因表达的本质研究不够深入

scRNA-seq：

2009年由Tang发表，但直到14年才降低测序费用，逐渐进入大家的视野。它测定的是细胞种群中每个基因的表达量分布，对于研究特定细胞转录组的变化是重要的。测定的细胞量也由最初的10² 涨到了10⁶ 并且还在递增，向着高通量的方向发展。现在有许多处理单细胞测序的流程，比如13年的SAMRT-seq2，12年的CELL-seq，15年的Drop-seq。有一些做单细胞的平台，包括Fluidigm C1、Wafergen ICELL8、10X Genomics Chromium。

发展历史

单细胞测序的流程：

测序流程

看着和普通的mRNA转录组差不多，取材要求更高了

分析流程

黄色部分对于高通量数据的处理都是差不多的流程；橙色的部分需要整合多个转录组分析流程以及显著性分析，来解决单细胞测序的技术误差；最后是下游表达量、通路、互作网络等生物类别的分析，需要使用针对单细胞研发的方法

可以借助许多工具：

• Falco [云端处理流程]

• SCONE(Single-Cell Overview of Normalized Expression)—一个质控和标准化的包

• Seurat-- QC以及后续分析探索数据

• ASAP(Automated Single-cell Analysis Pipeline) —交互式网页分析

面临挑战：

单细胞转录组与群体转录组的最大不同之一就是：测序文库是建立在单独一个细胞上的，并非一群细胞。单细胞目前面临的挑战主要是：扩增量目前最多是一百万个细胞；有可能一个基因在一个细胞中能检测到中等表达量，但是在另一个细胞中却检测不到，这种现象叫做"gene dropouts"。下一步需要增加转录本捕获效率，减少扩增误差

分析方法：

近几年，发展起来的方法很多，大体上（并不全面）包括：

• CEL-seq (Hashimshony, 2012)

• CEL-seq2(Hashimshony, 2016)

• Drop-seq(Macosko, 2015)

• InDrop-seq (Klein, 2015)

• MARS-seq(Jaitin, 2014)

• SCRB-seq(Soumillon, 2014)

• Seq-well (Gierahn, 2017)

• Smart-seq (Picelli, 2014)

• Smart-seq2 (Picelli, 2014)

• SMARTer

• STRT-seq (Islam, 2013)

方法主要分为两大部分：定量与捕获。

• 定量包括两种类型：全长以及基于标签(tag)。前者对每个转录本都试图获得一致的read覆盖度，后者只捕获5‘或者3’端的RNA。定量方法的选择也影响了后续分析的方法选择。理论上，全长的方法应该得到转录本的平均覆盖度，但是实际上，覆盖度经常是有偏差的。基于标签的方法能够利用特异性分子标记(Unique Molecular Identifiers, UMIs)提高定量准确度，但是呢，这种限制了转录组一端的方法有降低了转录本的可拼接性，让以后的isoform识别变得困难。

• 捕获的技术决定了细胞如何被筛选、获取怎样的测序外的补充信息、数据产量，三种最常用的方法是基于微孔microwell-、微液流microfluidic-、微滴droplet-

  基于微孔的捕获技术可以使用细胞移液器或激光捕获分离细胞，并将他们放置于微液流孔中。这样的一个优势就是：可以与荧光触发细胞分离技术(FACS)结合，实现基于表面标记的细胞选择。对于想要分离特定细胞群的研究很有效；另外一个优势就是，可以对细胞进行拍照，帮助确定孔中是否存在损伤的或者重复的细胞。当然，他也有缺点，通量低，对每个细胞进行操作需要很大的工作量。

  基于微液流的捕获技术 例如Fluidigm's C1

  Fluidigm's C1

相对微孔，它的通量更高。但是他的弱点就是：只有10%的细胞能被捕获到，加入处理的细胞类型比较稀少，那么能被芯片捕获的就更少了，数据产出是不够的。另外芯片相对较贵，但是试剂的价格再降低，日后可能总的价格也会下降。

微滴技术 是将单个细胞包裹在µl级别的液滴中，液滴被搭载到建库所用的酶上，每个微滴包含一个独特的条码(barcode)，由那个被包装好的细胞产生的所有reads都被贴上了该条码，也是为了之后对于不同细胞reads的分辨。一般微滴技术的通量最大，查资料得知一秒能包装7万个以上的液滴，并且建库费用合适--0.05美元/细胞。但是高额测序费用又成了他的短板，鉴定出的一般只有一千多个差异转录本，覆盖度还是比较低的

微滴技术

如何根据实验选择测序平台？

关于捕获，比如：如果想要分析组织中的成分，那么微滴技术可以提供数量可观的细胞；如果研究的细胞种群比较稀少，并且有已知的标记，那么最好用FACS，测少量细胞即可；关于定量，比如：如果想要研究不同的转录本，由于标签是有限的，不可能全部标记完这些转录本，那么全长的转录本定量就更合适；UMIs只能用于使用标签的方法，在基因水平做定量更有优势。

2017年Ziegenhain所在的Enard团队和Svensson所在的Teichmann团队都比较了不同的方法组合：

• Ziegenhain使用同样的小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells，mESCs)分析了5种不同的方法，控制细胞数量、测序深度一致，比较了方法的检测灵敏度、噪声水平以及各个方法的费用。结果显示了检测到基因的数目（给定一个检测阈值），结果显示drop-seq检测到的基因数目比Smart-seq2低了两倍。因此，方法的选择对于实验结果很重要！
  Enard团队

• Svensson使用的是已知浓度的合成的转录本(加入了spike-in)来检测不同方法的准确度和敏感度
  Teichmann团队

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